雙向凝膠熒光染色與成像實驗

試劑、試劑盒：

提取液                                                                  

洗滌液                                                                 

溶解液                                                                 

第一向電泳緩沖液                                                                  

還原溶液                                                                  

烷基化溶液                                                                 

瓊脂糖溶液                                                                  

丙烯酰胺凝膠溶液 

儀器、耗材：

雙向凝膠電泳                                                                  

光掃描儀或密度計

實驗步驟：

3.1 可溶性總蛋白的提取方法（三氯乙酸/丙酮法）

( 1 ) 從擬南芥細胞懸浮培養液中收集細胞。

( 2 ) 液氮中研磨細胞。

( 3 ) 向研磨好的細胞粉末中加入提取液，在 -20℃ 放置至少 30 min ( 見注釋 7) 。

( 4 ) 42000 g 離心以除去不溶物，用洗滌液（見注釋 8 ) 清洗 3 次 （見注釋 8)。

( 5 ) 將管子放置在空氣中使其干燥。

( 6 ) 在溶解液中振蕩沉淀 2 h 溶解蛋白（見注釋 9) 。

( 7 ) 根據 Bradford 法 [ 3，4] 測定蛋白濃度，使用等份樣品和血清白蛋白作標準曲線 ( 等份樣品是指相同比例的溶液）。

3.2 雙向凝膠電泳

( 1 ) 直接用第一向電泳溶液相匹配的 100 μg 蛋白質溶液水化 IPG 膠條（18 cm，pH 4.0~7.0) 。

( 2 ) 進行等電聚焦直至 100 kV/h。

( 3 ) 進行第二向電泳前，在還原液中將蛋白質還原后再用烷化液將蛋白質進行烷基化處理，兩者各 15 min。

( 4 ) 將膠條用瓊脂糖溶液包埋在 11% 的丙烯酰胺膠的頂端。

( 5 ) 在電泳緩沖液中進行 SDS-PAGE，每塊膠 15 mA，10°C 過夜（見注釋 10)。

3.3 CCB 染色和成像（見注釋 11、注釋 12)

根據 Neuhoff 等的方法對凝膠進行染色。每一步操作中，每塊膠使用 300 ml 溶液。所有操作均需振蕩。

( 1 ) 將凝膠浸沒在固定液中至少 2 h 或者過夜以固定蛋白。

( 2 ) 用水清洗凝膠三次，共 30 min。

( 3 ) 將凝膠轉移到培育液中培育 1 h  ( 見注釋 13)，然后再轉移到染色液中（見注釋 13、注釋 14)。

( 4 ) 輕微振蕩，在染色液中顯影 5 天。

( 5 ) 用水清洗凝膠，用掃描儀在 300 dpi 分辨率下獲取圖像（圖 14-1)。


3.4 SN 染色和成像（見注釋 11、注釋 12)

根據 Mortz 等 [15] 的方法對凝膠進行染色。每一步操作中，每塊膠使用 300 ml 溶液。所有操作均需振蕩。

( 1 ) 將凝膠浸沒在固定液中至少 2 min 或者過夜以固定蛋白質。

( 2 ) 用洗滌液清洗凝膠 3 次共 20 min。

( 3 ) 在敏化液中短時間浸泡凝膠（2 min) ( 見注釋 15)。

( 4 ) 用水清洗凝膠 3 次，5 min。

( 5 ) 在染色液中浸染凝膠 20 min。

( 6 ) 用水快速清洗凝膠 2 次 共 1 min。

( 7 ) 將凝膠放入顯色液中 5~10 min  ( 見注釋 16)。

( 8 ) 在終止液中終止顯色 5 min 后將凝膠轉移到貯存液中。

( 9 ) 使用掃描儀在 300 dpi 分辨率下獲得圖像（圖 14-1)。

3.5 SR 染色和成像（見注釋 11、注釋 12 和注釋 17 )

每一步操作中，每塊膠使用 300 ml 溶液。所有操作均需振蕩。

( 1 ) 將凝膠浸沒在固定液中 30 min 以固定蛋白。

( 2 ) 凝膠在染色液中侵染至少 30 min ( 最多 1 h ) 。

( 3 ) 用洗滌液清洗凝膠 30 min。

( 4 ) 使用帶 473 nm 激光激發和長通道濾光鏡 Y510 的 FLA-5000 分析儀獲取圖像。選擇條件為 100 μm 分辨率、16 位灰度、光電管電壓 700 V ( 圖 14-2 )。



3.6 DP 染色和成像（見注釋 11、注釋 12 和注釋 17)

每一步操作中，每塊膠使用 300 ml 溶液。所有操作均需振蕩。

( 1 ) 將凝膠浸沒在固定液中 1 h 以固定蛋白。

( 2 ) 用水清洗凝膠 4 次，每次 10 min。

( 3 ) 凝膠在染色液中浸染 1 h。

( 4 ) 用洗滌液 1 清洗凝膠 2 次、10 min，然后再用洗滌液 2 清洗 2 次，10 min。

( 5 ) 使用帶 532 nm 激光激發和長通道濾光鏡 0575 的 FLA-5000 分析儀獲取圖像。選擇條件為 100 μm 分辨率、16 位灰度、光電管電壓 700 V ( 圖 14-2) 。

3.7 C16-F 染色和成像（見注釋 10、注釋 11、注釋 17 和注釋 18)

根據 Kang 等 [27] 的方法對凝膠進行染色。每一步操作中，每塊膠使用 300 ml 溶液。所有操作均需振蕩。

( 1 ) 將凝膠浸沒在固定液和染色液中對蛋白同時進行固定和染色。

( 2 ) 用洗滌液至少清洗凝膠 2 次，每次 5 min。

( 3 ) 使用帶 473 nm 激光激發和長通道濾光鏡 Y510 的 FLA-5000 分析儀獲取圖像，選擇條件為 100 μm 分辨率、16 位灰度、光電管電壓 700 V  ( 圖 14-2) 。

3.8 染料間的比較

以上染色方法中，當上樣為 100 μg 擬南芥組培細胞中提取的總可溶性蛋白時，CCB 通常可檢出 250 個蛋白質點，C16-F 可檢出 450 個蛋白質點、DP 可檢出 550 個蛋白質點、SN 可檢出 600 個蛋白質點、SR 可檢出 800 個蛋白質點（圖 14 -1 和 圖 14-2) 。表 14-1 中總結了這些方法的主要特征。根據染料類型、染色步驟和操作時間對染色方法進行了比較。圖像質量通過背景效果、點飽和度和染料敏感度進行了評價。