六、第二向 SDS-PAGE
1．[基本原理]
蛋白質在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果加入一種試劑消除電荷、形狀等因素的影響，使電泳遷移率只取決于分子的大小，就可以用電泳技術測定蛋白質的分子量。1967年，Shapiro等發現在樣品介質和聚丙烯酰胺凝膠中加入陰離子去污劑和強還原劑后具有這種作用并建立了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。之后，Weber，Glossmann和Douglas等人進行了多次改進，已顯示出了在分離、鑒定和純化蛋白質方面的優越性。
SDS(十二烷基硫酸鈉)是一種陰離子還原劑，作為變性劑和助溶性試劑，它能夠斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質分子的二級結構和三級結構。強還原劑，例如β-巰基乙醇（β-mercapto
ethanal）和二硫蘇糖醇（dithiothreitol，
DTT）則能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂，不易再氧化，這就保證了蛋白質分子與SDS的充分結合。
當向蛋白質溶液中加入足夠量SDS和還原劑后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈與SDS充分結合形成蛋白質-SDS
復合物,這種復合物由于結合大量帶負電荷的SDS，好比蛋白質分子穿上了帶有負電荷的“外衣”。蛋白質-SDS復合物所帶的SDS負電荷的量大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質間原有的電荷差別，另一方面，蛋白質-SDS復合物的形狀是類似于“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質的SDS復合物的短軸長度是恒定的，約為18埃，而長軸的長度則與蛋白質分子量大小成比例，這樣的蛋白質—SDS復合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質原有的電荷和形狀的影響，而取決于橢圓棒的長軸長度，即蛋白質或者亞基的分子質量的大小。因此，SDS-PAGE可以按蛋白質的分子大小的不同將其
分開。當蛋白質亞基的分子質量在15kDa到200kDa之間時，電泳遷移率與分子質量的對數呈線性關系。若用已知分子量的一組蛋白質作圖繪制標準曲線，在同樣條件下檢測未知樣品，就可從標準曲線推算出未知樣品的分子量。
2．[操作步驟]
1.
灌膠事先裝好灌膠模具，倒入凝膠溶液。灌膠后立即在每塊凝膠上鋪上一層水飽和正丁醇或異丁醇，以減少凝膠暴露于氧氣，形成平展的凝膠面。同時灌注多塊凝膠時，在室溫下至少聚合3個小時。聚合后倒掉覆蓋在凝膠上的正丁醇溶液，并用凝膠儲存液沖洗凝膠表面。暫時不用的凝膠可用塑料薄膜包好于4℃保存1-2天。將整個凝膠模具完全浸沒在凝膠儲存液中可4℃條件下保存1-2周。
2.
IPG膠條的轉移用去離子水潤洗一下膠條，將膠條的邊緣至于濾紙上幾分鐘，去除多余的平衡液。然后將膠條放在玻璃板之間的凝膠面上，使膠條支持膜貼著其中的一塊玻璃板，用一薄尺將IPG膠條輕輕的向下推，使整個膠條的下部邊緣與凝膠上表面完全接觸。確保在IPG膠條與凝膠表面之間及玻璃板與塑料支持膜之間無氣泡產生。
3. 加入分子量標準蛋白分子量標準蛋白溶液與等體積的1%瓊脂糖溶液混合后，加入到IEF上樣紙片上，然后將上樣紙片用鑷子放置在IPG膠條末端一側，與凝膠表面接觸。
4. 封頂最后用瓊脂糖密封液進行封頂，用少量的密封液是IPG膠條被完全覆蓋住，在此過程忠不要產生氣泡。
5. 電泳步驟待瓊脂糖凝固后，電泳槽中裝滿電泳緩沖液，并打開溫控系統，調節溫度在15℃。將膠盒插入電泳槽中，調節電泳參數，電流（mA/gel)15mA 時間（h:min) 15min ， 30mA 3h
6. 打開電源開始電泳，當溴芬蘭染料遷移到膠的底部邊緣即可結束電泳。
7. 將跑好的膠轉移到染色盒中固定，準備染色。
3．[試劑準備]
1. 丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺溶液30%丙烯酰胺和0.8%甲叉雙丙烯酰胺溶液，將60g丙烯酰胺和1.6g甲叉雙丙烯酰胺溶解于去離子水中，最后用去離子水將體積不足到200ml..
2. 分離膠緩沖液1.5M Tris-HCl ,Ph8.6和0.4%（w/v）SDS：90.85g Tris和2gSDS溶于400ml去離子水中，用6N HCl調節pH到8.6，最后用去離子水將體積補足到500ml.
3. 10%（w/v）過硫酸銨溶液： 1g過硫酸銨溶于10ml去離子水中。此溶液需使用前新鮮配制。
4. TEMED
5. 覆蓋液（緩沖液飽和的異丁醇）： 混合20ml上述分離膠緩沖液和30ml異丁醇，等幾分
鐘后去掉異丁醇層。
6. 取代液（50%(v/v)甘油和0.01%溴酚藍水溶液）： 混合250ml甘油（100%）和250ml去離子水，再加入50mg溴酚藍，攪拌幾分鐘。
7. 低熔點瓊脂糖溶液：含有0.5%(w/v)低熔點瓊脂糖的電極緩沖液。
8. 低分子量標準蛋白
七、膠上蛋白質的檢測
1．[基本原理]
顯示雙向凝膠上的蛋白質點的方法有多種，例如，考馬斯亮藍R-250(CBB R-250)、CBB G-250、酰胺黑（Amido
Black）、麗春紅S(Ponceau S)
、銀染、負染、熒光染料染色以及放射性同位素標記等。用于二維電泳常規檢測和定量的普遍方法是考馬斯亮藍染色和銀染。近年來由于測序技術和質譜靈敏度的提高，尤其是最新的Q-TOF類液相色譜串聯質譜技術的發展，大大提高了質譜鑒定的靈敏度，從而使蛋白質顯色的地位從簡單的蛋白質點呈現轉換為集成化的蛋白質微量化學表征過程的關鍵步驟。隨著高靈敏度蛋白質分析方法和電泳后技術的結合，考馬斯亮藍染色和銀染在蛋白質組學研究中的局限性日益暴露出來。而新的染色技術如熒光標記、同位素標記技術在提高靈敏度的同時，也與自動化的蛋白質平臺切膠技術相兼容，染色技術向高靈敏度和自動化方向發展。不同的染色方法對設備和儀器要求不同，在實驗中綜合考慮各種因素，以選擇最佳方案。下表給出了各種不同類型染色方法的靈敏度、對軟硬件的要求、質譜兼容性等性能指標。見表-2。