雙向電泳操作步驟——雙向電泳操作步驟

細胞樣品

ddH2O溴酚藍指示劑礦物油丙烯酰胺乙醇MilliQ 水飽和正丁醇SDS瓊脂糖

樣品水化盤冰箱厚濾紙搖床電泳槽電泳儀鑷子二向電泳制冷儀手套

一、樣品制備。

1.  稱重后將樣品加入Dounch勻漿器。每100 mg 組織加入1.5——2.0 ml SDS/或尿素/溶解緩沖液，用B號研棒沖擊50次，然后以A號研棒沖擊50次。

2.  放置幾分鐘后，取一小份樣品于200 μl 離心管100 000 g 離心2 h 以上或在200 000 g 以上離心1 h。保留上清（蛋白樣品）。加樣于第1向凝膠上。

二、第一向等電聚焦。

1.  在干凈的1.5 mm 內徑的凝膠柱管上作好標記以指示應灌制凝膠柱的髙度。用橡皮筋將凝膠柱管捆綁成束，在一水平面上垂直豎起管束，從其頂部向下推壓，使各柱管的底部平齊。

2.  用三、四層Parafilm膜小心封好2.5——3.0 cm 內徑的凝膠灌制管的一端，使之形成一個結實的水密性的密封面。

3.  將凝膠柱管束放入凝校灌制管內，用環形支架和夾子將灌制管固定在垂直的位置，并使其密封端置于一水平面之上。

4.  加8.25 g 尿素、6.0 ml 水、2.0 ml 30%丙烯酰胺/1.8%亞甲雙丙烯酰胺、0.75 ml pH4——8的Ampholytes 兩性電解質于一個小的真空瓶中。瓶內加一小攪棒，將瓶子置于磁力攪拌器的溫水浴中，攪拌至尿素全溶于水，不要加熱使溶液溫度超過30℃。

5.  在強真空下脫氣2——3 min，加入0.3 ml NP-40，搖晃使之溶解混勻。

6.  將溶液倒入帶0.2或0.45 μm 針頭式濾器的注射器中，推壓使之通過濾器。加入10 μl TEMED，搖勻；再加70 μl 過硫酸銨，搖勻。立即用吸管將溶液加入到凝膠柱管和大的凝膠灌制管之間的空間。

7.  用一洗瓶輕輕地在凝膠往管的外面加入水，直至將丙烯酰胺溶液壓進拄管至所設定的高度，放置使凝膠聚合。

8.  取去凝膠灌制管底部的Parafilm膜從底部將含有聚合好凝膠的凝膠管推出，用單刃刀片切去管子底部多余的丙烯酰胺。并在流動的去離子水下沖洗，除去殘余的丙烯酰胺。

9.  在每根管子的頂部套上橡皮扣眼，留意在扣眼下仍可看見凝膠的頂部，在扣眼上需留約5 mm 凝膠管。

10.  將凝膠管連同扣眼安裝在上緩沖液槽的孔眼中，多余的孔眼用橡皮塞子堵緊。

11.  往下緩沖液槽加入大約3 L 0.085%的磷酸。

12.  將上、下緩沖液槽安放在一起，調整下緩沖液槽使液面蓋沒凝膠。

13.  上緩沖液槽加入250 ml 0.02 mol/l 的NaOH，用帶22G皮下針頭的1 ml注射器將凝膠管的頂部用0.02 mol/l 的NaOH充滿，小心排去凝膠管中的所有氣泡。

14.  連接電源，黑色的導線接于上槽。在200 V 恒壓下預聚集1 h 撤開電泳槽與電源的連接。

15.  用50 ml 注射器將10——30 μl 蛋白質樣品穿過凝膠管上的緩沖液直接加在凝膠的表面。

16.  蓋上上槽蓋后，連接電源。打開電源調到設定電壓，恒壓電泳16 h。

17.  將電壓調到零位，關閉電源，結束電泳。用50 μl 注射器往毎根凝膠的頂部加入約1 μl 濃溴酚藍溶液。

18.  用一個裝上了 200 μl 移液器的吸頭的注射器，將凝膠用水壓從凝膠管中擠出。

19.  將凝膠放入作好標記的小瓶中，凝膠可立即使用或在-70℃放置數周。

20.  凝膠管在鉻酸冼液中浸泡過夜，在流動的去離子水中沖冼15 min。吸干管子中多余的水分，使之干燥。

三、第二向SDS電泳。

1.  用墊片組裝凝膠平板。夾層每邊的墊片之上用夾子固定，并置于凝膠支架上。注意玻璃平板和墊片的平齊，收緊夾子以保證密封圈不發生泄漏。調整平板的水平和垂直，在平板間將放上凝膠識別標簽，使之留在右下角。

2.  在一個真空瓶中分別加入30%丙烯酰胺/0.8%亞甲雙丙烯酰胺，凝膠緩沖液和水，配制凝膠溶液。真空下脫氣5 min。

3.  加入10%SDS和TEMED，搖勻；再加入10%過硫酸銨，搖勻。

4.  加入溶液于凝膠夾層中，加至離短的玻璃平板頂部5 mm 處，上面加一層水飽和異丁 醇或水，使凝膠聚合1.5 h。

5.  入平衡緩沖液完全覆蓋第1向凝膠。

6.  將凝膠連同平衡緩沖液一起倒于一個置于一燒杯之上的尼龍網篩上，然后將凝膠移于一 5 cm ×15 cm 的玻璃平板上，用小鏟將凝膠沿凝膠夾層的一邊放好。

7.  用吸管往將要加樣的平板凝膠的頂部加一很薄的熱的0.5%瓊脂糖。

8.  用小鏟小心地將第1向凝膠滑到玻璃平板并橫跨于平扳凝膠的頂部，第1向凝膠藍染的一端靠右。

9.  往第1向凝膠上加一層熱的0.5%瓊脂糖，讓瓊脂糖固化并將凝膠固定。

10.  將凝膠夾層安置于電泳槽中。往上、下槽加入預冷的電泳緩沖液。

11.  用管子將冷卻劑的入口和出口連好，開始讓冷卻劑流動，使電泳槽中緩沖液的溫度保持在10——20℃，保證電泳過程中凝膠得到充分的冷卻。

12.  用導線將電泳室與電猓連接，每片凝膠在15——20 mA的電流下電泳至指示染料到達凝膠的底部。

13.  在電泳結束時將電壓調至零位，關閉電源。從電泳單元中取出凝膠夾層，并取走夾子。 用小鏟將玻璃平板橇起。

四、凝膠的染色。

五、凝膠掃描和分析。

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在離心前，樣品在SDS/溶解緩沖液中煮沸5 min，千萬不要在尿素/溶解緩沖液中加熱樣品。在第1向電泳前離心樣品。

常見問題：

1.重泡脹后的膠可以不用轉移到另一個電泳槽，直接跑 2D 的一向嗎？

一般情況下是可以的。但當上樣量特別大時，可能會有一部分蛋白質沒有被膠條吸收，這樣跑完 1D 和 2D 膠后，會有很多橫向條紋。所以在這種情況下，最好在重泡脹后，將膠條轉移到另外一個電泳漕中進行電泳。

2.為什么我在等電聚焦前加的礦物油在聚焦后會減少，暴露出了膠條的背面？

通常情況下，等點聚焦中體系內除了蛋白質還會存在少量帶電小分子，當這些帶電小分子在電場中向兩極運動時，會帶動膠條中的水分子運動，水分子運動會帶動附近的覆蓋油移動，當樣品質量不高，帶電小分子較多時，會導致覆蓋油移動嚴重溢出膠條槽，此時，通常會伴隨膠條的酸性端膠條厚度增加。當發生覆蓋油溢出或膠條暴露時，應及時補加覆蓋油。為了防止這個現象的發生，應從樣品制備時嚴格控制樣品質量，盡量減少帶電小分子如鹽離子的含量。同時可以在相鄰的空電泳槽里，也加入適量（80 %滿）的覆蓋油。

3.跑第一向時，為什么要設定一個電流的最大值電壓（50 μ A/ 膠）？

電流的平方和功率成正比。電流增大，功率增大，放出的熱量也隨之增大，就會導致膠條的溫度增加。當溫度超過 30 攝氏度時，緩沖液里的尿素就容易解離，產生一些極性分子，修飾蛋白，從而對等電聚焦產生影響。

4.跑第一向時，為什么剛開始的電壓比較低，而后逐漸增高？

剛開始時，體系內的帶電小分子比較多（比如無機鹽和雙極性分子）。所以在這個階段，電流主要是由這些小分子的移動所產生的。由于這些分子質量小，移動他們不需要很高的電壓。當這些小分子移動到他們的目的地時（無機鹽移動到極性相反的電極；兩性分子移動到對應的 pH 條帶），體系內的蛋白質才開始肩負起運載電流的任務，逐漸向所對應的 pH 區域移動，而蛋白質運動需要較高的電壓。

5.跑第一向時，為什么會產生一條藍色的條帶，并逐漸向酸性端移動？

藍色條帶是緩沖液中痕量的溴酚藍被聚焦所產生的。溴酚藍也是 pH 指示劑，當它移動到酸性區時（pH4），顏色會變成黃色。溴酚藍的這個移動過程大體上發生在極性小分子的聚焦之后，蛋白質大分子聚焦之前。

6.跑第一向時，為什么電壓總達不到預定值？

當上樣量比較大時或體系內鹽分比較多時，聚焦的電壓有可能達不到所設定的數值。

跑第一向時，在電壓達到預定值后，電流為什么會降低？

當上樣量比較少時，所有蛋白在較短的時間內就移動到所對應的 pH 值區域值，從而變成中性分子。這樣，體系的電阻越來越大，在恒定的電壓下，電流就會越來越小。

7.跑第一向時，為什么在兩個電極絲附近有氣泡產生？

等電聚焦完成后，所有的蛋白質都移動到了相應的 pI 值區域，而成為中性分子。這時加在體系上的電壓就開始電解水分子，在陽極產生氧氣，在陰極產生氫氣。

8.重泡脹緩沖液（rehydration buffer）中的硫脲的作用是什么，雙極性分子的作用是什么？

硫脲的作用是增加蛋白質的溶解性，特別是堿性蛋白的溶解性。雙極性分子的作用也是增加蛋白質的溶解性。當蛋白移動到相應的 pH 值后，就變成了中性分子。而不帶電荷的蛋白質分子容易聚集，從而降低其在隨后的二向膠時的遷移效率，可能會造成豎的脫尾。而硫脲和雙極性小分子則會鑒定中性蛋白質之間的相互作用，防止它們的聚集。

9.怎樣估計 2D 膠上蛋白質點的分子量和 pI 值？

可以根據膠條的pH范圍和長度估算蛋白質點的pI值，在第二向中加入分子量Marker估算蛋白質點分子量。也可以用體系內已知蛋白來做比對。

10.為什么 2D 膠上的蛋白點有橫的和豎的脫尾？

橫的脫尾可能是：1）一向等電聚焦不完全； 2）某些蛋白質本身的原因（糖蛋白）； 3）蛋白的豐度太高。豎的脫尾可能是1）平衡時碘乙酰胺量不足；2）跑二向時，蛋白的溶解度不好。

11.什么成分會影響 2D 膠的效果？

核酸，鹽，去垢劑等等。

12.2D 膠的上樣量應該在什么范圍？

上樣量和樣品有關。樣品內蛋白種類多的上樣量要大些，這樣每個點才有足夠的量被檢測到。一般的全細胞裂解體系，上樣量大概在 100 微克（銀染）到 500 微克（考染）之間。

13.我的蛋白質濃度很低，應該用什么方法來濃縮？

蛋白質的濃縮有很多方法。大致有超濾法，沉淀法和透析法。超濾比較溫和，對蛋白質不會有修飾和改變，蛋白的種類一般不會有丟失。它的缺點是總樣品的量可能會減少（被膜所吸附）。另外超濾對樣品的要求比較高。甘油，去垢劑都會堵塞濾膜，影響超濾的效果。沉淀法比較快速，容易操作，對鹽，甘油，去垢劑的耐受性好。缺點是可能會有部分種類的蛋白沒有被沉淀下來（丟失）。沉淀法中，又以 TCA 法最為普遍使用。使用 TCA 法時，一定要用冷的純丙酮清洗蛋白沉淀兩次，去處殘留的 TCA 和其他沉淀下來的雜質。透析法只使用于量比較大的樣品，量小時，操作困難。透析法可以和超濾法聯用。先把樣品透析到一個比較干凈的環境（不含鹽，甘油，去垢劑或其它雜質，比如碳酸氫氨溶液），然后再進行超濾。