蛋白質組研究的發展以雙向電泳技術作為核心.
雙向電泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分離約1 000個E.coli蛋白，并表明蛋白質譜不是穩定的，而是隨環境而變化.
雙向電泳原理簡明，第一向進行等電聚焦，蛋白質沿pH梯度分離，至各自的等電點；隨后，再沿垂直的方向進行分子量的分離.
目前，隨著技術的飛速發展，已能分離出10 000個斑點(spot). 當雙向電泳斑點的全面分析成為現實的時候，蛋白質組的分析變得可行.
樣品制備(sample prepareation)和溶解同樣事關2-DE的成效，目標是盡可能擴大其溶解度和解聚，以提高分辨率.
用化學法和機械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白，兩者聯合有協同作用. 對IEF(isoelectric
focusing)樣品的預處理涉及溶解、變性和還原來完全破壞蛋白間的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物質.
理想的狀態是人們應一步完成蛋白的完全處理. 而離液劑2
mol/L硫脲和表面活性劑4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白從IPG(immobilized pH gradients)膠上的轉換.
三丁基膦(Tributyl phosphine，TBP
)取代β-巰基乙醇或DTT完全溶解鏈間或鏈內的二硫鍵，增強了蛋白的溶解度，并導致轉至第二向的增加］.
兩者通過不同的方法來增加蛋白的溶解度，作為互補試劑會更有效. 在保持樣品的完整性的前提下，可利用超離和核酸內切酶去除核酸(DNA).
除此之外，機械力被用來對蛋白分子解聚，如超聲破碎］等. 另外，添加PMSF等蛋白酶抑制劑，可保持蛋白完整性.
由于商品化的IPG膠條是干燥脫水的，可在其水化的過程中加樣，覆蓋整個IPG膠，避免在樣品杯中的沉淀所致的樣品丟失］. 此外，低豐度蛋白(low
abundance protein)在細胞內可能具有重要的調節功能，代表蛋白質組研究的“冰山之尖”，故分離低豐度蛋白是一種挑戰.
亞細胞分級和蛋白質預分級、提高加樣量(已達到1～15 mg級的標準)、應用敏感性檢測，可以提高其敏感性.
如一種多肽免疫2-DE印跡(MI-2DE)是利用幾種單克隆抗體技術來分析和檢測. 提高組蛋白和核糖體蛋白等堿性蛋白(basic
proteins)的分離是另一難點.
由于堿性pH范圍內凝膠基質的不穩定及逆向電滲流(EOF)的產生，對PI(等電點)超過10的堿性蛋白，通過產生0～10%的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之.
亦可用雙甲基丙烯酰胺來增加基質的穩定性.
2-DE面臨的挑戰是高分辨率和重復性. 高分辨率確保蛋白最大程度的分離，高重復性允許進行凝膠間配比(match).
對2-DE而言，有3種方法分離蛋白：1)ISO-DALT(isoelectric focus)以O’Farrell’s技術為基礎.
第一向應用載體兩性電解質(carrier ampholyte, CA)，在管膠內建立pH梯度.
隨著聚焦時間的延長，pH梯度不穩，易產生陰極漂移. 2) NEPHGE(non-equilibrium pH gradient
electrophoresis)用于分離堿性蛋白(pH>7.0). 如果聚焦達到平衡狀態，堿性蛋白會離開凝膠基質而丟失.
因此，在等電區域的遷移須在平衡狀態之前完成，但很難控制. 3)IPG-DALT發展于80年代早期. 由于固相pH梯度(Immobilized
pH gradient, IPG)的出現解決了pH梯度不穩的問題.
IPG通過immobiline共價偶聯于丙烯酰胺產生固定的pH梯度，克服了IEF的缺點，從而達到高度的重復性.
目前可以精確制作線性、漸進性和S型曲線，范圍或寬或窄的pH梯度. 新的酸性pH 3～5或堿性pH 6～11的IPG凝膠梯度聯合商品化的pH
4～7的梯度可對蛋白質形成蛋白質組重疊群(proteomic contigs)從而有效分離.
分離后的斑點檢測(spot detection)亦很重要. 所采用的檢測策略和分離后所采用的方法的相互作用是很重要的.
此外，還需考慮反應的線性、飽和閾/動態范圍、敏感性、對細胞蛋白群的全體定量分析的適應性、可行性.
目前，沒有一種蛋白染色覆蓋廣泛的濃度和PI及分離后分析技術.
銀染已成為一種檢測2-DE的流行方法，可檢測少到2～5ng的蛋白，因此較考馬斯亮藍R-250敏感.
多數糖蛋白不能被考馬斯亮藍染色，一些有機染料不適于PVDF膜. 放射性標記不依賴其代謝的活性，并僅適于對合成的蛋白質檢測.
另有一種改良的2-DE(差異凝膠電泳)，即應用兩種不同的染料熒光標記兩個樣品，使在同一凝膠上電泳后的凝膠圖象為兩個，避免了幾種2-DE的比較，可在納克級進行檢測.
較早期相比，2-DE有兩個主要的進步：首先，極高的重復性使有機體的參考圖譜，可通過Internet獲得，來比較不同組織類型、不同狀態的基因表達；其次，高加樣量使得2-DE成為一項真正的制備型技術.
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