雙氧水誘導腫瘤細胞凋亡——雙氧水誘導法

1. 實驗目的

通過實驗了解細胞凋亡的一般過程和形態特征，了解誘導細胞凋亡的因素；學習和了解細胞凋亡檢測的常規手段，掌握利用梯狀DNA電泳法鑒定細胞凋亡的方法。

2.實驗原理

細胞凋亡是多細胞生物體在發育過程中或在某些環境因子的作用下發生的受基因調控的主動的死亡方式。對于生物體的正常發育、自穩平衡及多種病理過程具有極其重要的意義。細胞凋亡（apoptosis）的概念最早由Kerr于1972年提出，當時用來描述某些類型的細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，主動地結束其生命，最終脫落離體或裂解為若干凋亡小體（apoptotic body）而被其細胞所吞噬的過程。

細胞凋亡的主要特征包括：染色質凝集、質膜出芽、核裂解及凋亡小體的形成。DNA特異性降解成180～200bp或其整數倍片斷，通過凝膠電泳形成梯狀條帶，稱為DNA Ladder。由于DNA特異性降解而產生大量3'-OH末端，可被末端脫氧核糖核苷酸移換酶介導的dUTP缺口末端原位標記法（TUNEL）標記，從而產生亮綠色熒光等。

1980年，Wyllie在研究糖皮質激素誘導胞腺細胞凋亡時發現內源性核酸內切酶活化及其引起的一系列形態學和生物化學方面的變化，提出了細胞程序化死亡（programmed cell Death, pCD）的概念。細胞的程序性死亡通常采取細胞凋亡的形式，因此嚴格地講細胞凋亡和程序性死亡并不是同一概念。凋亡主要是形態學方面的函義，而程序性死亡則側重于功能方面。但是通常人們并未加以嚴格區分而將這兩個概念等同使用。

細胞凋亡是多種生理、病理因子參與的由凋亡相關基因啟動的細胞程序性死亡過程，其中由氧應激造成大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）的產生以及繼發性細胞損傷過程在細胞凋亡中起著重要作用，如電離輻射或紫外線照射產生大量H2O2、OH等。造成的細胞凋亡。有關活性氧誘導細胞凋亡的詳細分子機制尚未得到闡明，部分學者根據一些實驗提出了相聯系關的假說進行了一些解釋。

人工誘導細胞凋亡所使用的OH可以通過Fenton反應而得到，即使用Fe2+與H2O2反應而生成。一般在實驗室中，采用一定濃度的FeSO4與H2O2進行。該反應經ESR證實可以在30min內持續穩定地產生OH。

3. 實驗用具及材料

Hela細胞系、普通光學顯微鏡、熒光顯微鏡、載玻片、蓋玻片、細胞培養瓶、生理鹽水、電泳儀、高速離心機、紫外檢測信、超凈工作臺、二氧化碳培養箱、恒溫水浴鍋、細胞記數器、DMEM培養基（GIBOCO公司）、溴酚藍指示液、臺盼藍染色液（20.0g/L生理鹽水配制）、DAPI染料、（4,6-diamidino-2-phenylindole）(Sigma公司)、TUNEL檢測試劑盒（Boehringer Mannheim公司）青霉素、鏈霉素、Rnase A、硫酸亞鐵（FeSO4）、雙氧水（H2O2）、50xTAE緩沖液、PBS緩沖液、裂解液等。

4. 實驗方法及步驟

1）細胞培養

Hela細胞培養在DMEM高糖培養基中，接種密度為1×104個/mL。培養基含有體積分數10%的胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/mL鏈霉素。細胞在37℃、體積分數5%CO2的條件下進行培養。定期觀察、傳代。當細胞生長到對數期時進行誘導凋亡的實驗。

2）細胞凋亡的誘導

培養的細胞處于對數生長期時，在無菌操作臺內將一定濃度的FeSO4與H2O2加進培養瓶。細胞處理的參考濃度如下：

組別 FeSO4/umol/L H2O2/umol/L

對照組 0 0

處理1 100 300

處理2 100 600

處理3 100 900

3）細胞凋亡的檢測

（1）臺盼藍染色（Typan blue）檢測細胞死亡率

因為生活狀態的細胞，其細胞結構完整，所以臺盼藍染料分子不能進入細胞內部。在光學顯微鏡下觀察細胞不著色。而壞死細胞的細胞膜出現破裂或細胞膜通透性提高，臺盼藍染料可以進入細胞內部，因此死亡的細胞呈藍色。細胞在凋亡過程中膜系統保持完整，因此臺盼藍染色細胞保持無色。

方法：①將培養的Hela細胞取出，加2～3滴細胞懸液于干凈的載玻片，滴加一滴臺盼藍染色液，染色1min后即可在顯微鏡下觀察。②選定細胞分散良好的視野，進行細胞死亡率的統計

細胞死亡率=死亡的細胞數目/統計的所有細胞數目

（2）DAPI熒光檢測

利用DAPI染料與細胞核內的DNA的結合，在紫外光的激發下發出熒光。因而在熒光顯微鏡下可以檢測細胞核形態的變化。

① 將生長在蓋玻片（預先用1mg/mL多聚賴氨酸處理）上的細胞進行Fe2+/H2O2的誘導。

② 用預冷的D-Hanks液洗2遍。

③ 甲醇固定30min。

④ 用D-Hanks液洗1遍。

⑤ 加入1μg/ml DAPI染料染色30min。

⑥ 在熒光顯微鏡下，UV波段進行熒光檢測觀察。

（3）TUNEL檢測（末端脫氧核糖核酸轉移酶介導的dUTP切口末端標記檢測）

凋亡的細胞中，由于啟動了內源的核酸內切酶在核小體間進行切割，因此其DNA產生子大量的3’-OH末端，在末端脫氧核糖核苷酸移換酶的作用于下通過催化dUTU的聚合而結合在裸露的確良3’-OH上，經熒光素標記后，在顯微鏡下進行觀察，TUNEL反應陽性的細胞發出亮綠色的熒光，而正常的或壞死的細胞很少產生3’-OH末端，因此呈陰性。

① 將生長在蓋片上的細胞經不同濃度的FeSO4和H2O2處理后，用預冷的D-Hanks液洗滌2遍。

② 用配制的體積分數4%的（溶于D-HankspH 7.4）多聚甲醛的室溫下固定30min，然后用D-Hanks液洗滌3遍。

③ 在預冷的穿透液中滲透2min，然后用D-Hanks液洗滌3次。

④ 加入50μL TUNEL的反應混合液（5μL末端轉移酶和45μL熒光標記核酸混合液）在37℃下于濕盒中反應60min。

⑤ 用D-Hanks液洗滌3遍后，用1：1的甘油-PBS封片，在熒光顯微鏡下進行觀察，照相記錄。

（4）DNA Ladder的檢測

在細胞凋亡過程中由于限制性內切酶被激活，細胞核DNA在核小體間發生特異性降解，形成180～200bp或其整數倍的片段，經過瓊脂糖凝膠電泳后呈現出梯狀條帶，即DNA ladder這一現象被視為細胞凋亡發生與否的典型特征。

①收集經處理、培養的細胞，用預冷的D-Hanks液洗滌3遍。

②以500g離心10min，棄掉上清液。

③在沉淀中加入預冷的裂解緩沖液。使細胞充分懸浮，然后在冰上裂解90min。

④以1200g離心10min。

⑤將上清液轉移到另一Eppendorf離心管中，加入等體積的酚/氯仿，并充分混勻，在4℃下放置1h。

⑥10000g離心30s。

⑦將液相轉移到一新的Eppendorf離心管中，加入終濃度為2mol/L的醋酸氨，兩倍體積的無水乙醇，-20℃下靜置過夜。

⑧12000g離心10min。

⑨真空干燥后，加入50μL無菌水溶解DNA。

⑩加入Rnase A（終濃度為1mg/mL），37℃下消化1h。

(11)取20μL樣品與上樣緩沖液按體積比5：1進行混合，以15.0g/L的瓊脂糖電泳（凝膠中含有終濃度為0.5(μgEB/mL)，電泳條件為1×TAE緩沖液，電壓5V/cm，當溴酚藍指示液移出3～4時停止電泳，在紫外檢測儀中進行觀察和照相記錄。注意：EB（溴化乙錠）有毒，應妥善處理使用過的瓊脂糖凝膠并加強自我防護。

5. 作業及思考題

（1）什么是細胞凋亡（apoptosis）?細胞凋亡與細胞壞死（necrosis）有什么區別？

（2）研究細胞凋亡與人類健康有什么聯系？

（3）根據本實驗結果計算不同處理情況下的死亡率和凋亡率，找出誘導細胞凋亡效率較高的處理濃度。

附錄I D-Hanks原液

氯化鈉 80.0g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4·2H2O） 0.6g

氯化鉀 4.0g

磷酸二氫鉀 0.6g

三蒸水 1000mL

附錄II D-Hanks工作液

D-Hanks原液 100mL

三蒸水 896mL

0.5%酚紅液 4mL

附錄III PBS緩沖液（pH 7.4）

K2HPO4 1.392g

NaH2PO4·H2O 0.276g

NaCl 8.770g

溶于90mL蒸餾水，以0.01mol/L KOH將pH調至7.4，最后定容至1000mL。

附錄IV 50×TAE緩沖液

Tris堿 242g

冰醋酸 57.1mL

0.5mol/EDTA 100mL

加蒸餾水至 1000mL

附錄V 0.5mol/EDTA

Na2EDTA·2H2O 186g