A．任何時候2 種酶的總量不能超過反應體系的1/10體積。
B．雙酶切時如果兩種酶反應溫度一致而buffer不同時，可查閱內切酶供應商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表（也可以向ebiotrade.com客戶服務部索取），如果有一種buffer能同時使2 種酶的活力都超過70% 的話，就可以用這種buffer作為反應buffer. 如果兩種酶廠家不同無法查時可比較其buffer成份，相似的話可以考慮各取一半中和。
C．如果2 種酶的buffer成份相差較大或2 種酶的反應溫度不同則必須分別做酶切。第1 種酶切后要考慮用酚抽、電泳或加熱等方法使酶失活后再進行下一次酶切反應。廠家目錄一般都會有相應的附錄以供查閱各種酶的反應溫度。有的酶可以用加熱使之失活，有的則不行，這些信息也可以在有關附錄中查詢，也可以向ebiotrade.com客戶服務部索取。
D． 第一次酶切后通過電泳確證酶切完全后可以從膠中回收DNA 片段再進行下次酶切，也可以在第一個酶切后直接用PCR 產物回收試劑盒或Nucleotide Removal Kit 純化酶切樣（只需5 分鐘），保留少量樣品做電泳分析之用，再進行下一次酶切。還可以用一種離心純化管或叫做離心濃縮管（Eppendorf ，S&S 等廠家有售），將酶切樣加入后離心，鹽等成份被過濾掉而核酸則被截留在柱子中間的膜上，加入適量ddH2O ，離心以洗去膜上殘留的雜質，再加幾微升ddH2O 在膜上，將柱子反轉插入新的eppendorf 管上，離心，即可將DNA 片段離下來，做下一次酶切。
E．特別注意：在雙酶切載體時如果2 個酶切位點靠得很近，必須注意酶切順序。因為有的限制性內切酶要求其識別序列的兩端至少保留有若干個堿基才能保證酶的有效切割。有的酶要求識別序列兩端有多個堿基的，則必須先切，否則就可能造成酶切失敗。比如質粒pLITMUS29 的多克隆位點中BamH I旁邊有HindIII 位點，如果先切BamH I再切HindIII 時就會出現HindIII 切不動的情況，但是反過來就沒問題。