改良的 EnVision-HRP/AP 雙酶雙底物的雙重免疫染色（間接法）——Ki-67-CK20 等多種組織抗原配對的雙重酶
| 實驗步驟 |
1. 恒冷切片或石蠟切片，厚 4～6 μm，常規處理。
2. 0.1％NaN3+0.3％H2O2/TBS（50 mmol/L，pH 7.8）或 0.3％H2O2/甲醇，室溫 20 min（阻斷內源性過氧化物酶活性）。
3. TBS 洗 5～10 min×3。
4. 一抗 CK20（McAb）1:100，4℃，過夜。
5. TBS 洗 5 min×3。
6. EnVision-HRP（羊抗鼠）試劑，室溫 30 min。
7. TBS 洗 5 min×3。
8. 正常鼠血清 1:10，室溫 15 min（封閉前重標記一抗的游離位點）。
9. TBS 洗 5 min×3。
10. 第二種特異性一抗 Ki-67（McAb）1:100，37℃ 孵育 120 min，TBS 洗 5 min×3。
11. 生物素化羊抗鼠 IgG1:400，37℃ 孵育 30 min。
12. TBS 洗 5 min×3。
13. 鏈霉親和素-AKP 1:400，37℃ 孵育 30 min。
14. TBS 洗 5 min×3。
15. 堿性磷酸酶底物顯色：NBT/BCIP，陽性產物呈紫藍色。
16. 聚合物連接的辣根過氧化物酶底物顯色（EnVision-HRP）：3-氨基-9-乙基卡巴唑/過氧化氫（AEC/H2O2），陽性產物呈紅色。
17. 洗滌后，10％ 緩沖甘油或明膠甘油封片。
18. 光學顯微鏡觀察。 展開 |
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| 注意事項 | 為了縮短操作流程，減少脫片率，有學者建議采用不同類別或亞型單克隆抗體混合使用，也同樣可獲得良好的雙標染色結果。 |
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