雙重PCR毛細管電泳法檢測大豆轉基因

陽性抗草甘膦轉基因大豆標準物質 進口轉基因大豆樣品 非轉基因大豆 寡核苷酸引物

溴乙錠 羥丙基甲基纖維素 三羥甲基氨基甲烷 Sulforhdamine B 三羥甲基氨基甲烷 乙二胺四乙酸 硼酸 Taq DNA 聚合酶 dNTPs pUC19DNA Msp I(HpaⅡ)Marker

毛細管電泳-激光誘導熒光檢測裝置 石英毛細管 UNO 型PCR儀 PAC3000型電泳儀 UVI紫外成像分析儀

1.總DNA提取

用CTAB法提取植物總DNA.

2.PCR體系及反應條件

雙重PCR反應體系：1×buffer,2.5mmol/L MgC12,0.25mmol/L dNTP,primers（0.4 μmol/L ZY1-35S,ZY2-EPSPS和0.4 μmol/L ZY3-NOS,ZY4-NOS），1.5units of Taq DNA Polymerase（MBI），模板DNA100——200ng,總反應體積25μ1.PCR循環參數：95℃預變性3min;95℃ 45s,55℃ 60s,72℃ 45s,共35個循環;72℃延伸5min.

內源基因（Lectin）的PCR 反應體系：1×buffer,2.0mmol/L MgC12,0.2mmol/L dNTP,0.2μmol/L primers.1.0 units of Taq DNA Polymerase（MBI），模板DNA1O0——200ng,總反應體積25μ1.PCR循環參數為：95℃預變性3min;95℃ 45s,58℃ 60s,72℃ 45s,共35個循環;72℃延伸5min.

3.PCR產物的高效毛細管電泳 在電泳分析前，先將毛細管柱填充1g/L HPMC,再充以含有3.75μmol/L溴乙錠的8g/L HPMC,電泳分離的緩沖溶液為TBE溶液（45mmol/L Tris,45mmol/L boric acid,1 mmol/L EDTA,pH 8.5）。取PCR擴增產物1Oμl加入內標2×0.0001mol/L Sulforhdamine B溶液0.5μl,在-1OkV下電動進樣20 s,并在-1OkV下恒壓電泳，用543.5nm 波長的激光激發DNA片段與溴乙錠的結合物產生熒光，在590nm波長下檢測。電泳溫度為20℃。每次電泳后用0.01 mol/L H3PO4溶液沖洗毛細管5min,再進行下一次檢測。pUC19DNA/Msp I（HpaⅡ）Marker用作DNA marker,使用時Maker用適量無菌水稀釋。電泳圖譜和實驗數據用C++語言編制的windows軟件進行采集和分析處理。

4.PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳 將5μl PCR產物與1μl上樣buffer混合后上樣于30g/L瓊脂糖凝膠中（含0.1μg/ml溴化乙錠）。在0.5×TBE電泳緩沖液中，于100V電壓下，電泳50min,采用pUC19DNA/Msp I（HpaⅡ）DNA Marker同時電泳，然后用UVI紫外成像分析儀觀察結果。

1.內徑為100μm的毛細管對DNA 片段標準物質pUC19DNA/Msp I（Hpa Ⅱ）Marker 中的110（111）/147 bp DNA 片段的分離度可達2.91,而且內徑為100μm的毛細管柱檢測光程較大，因而較內徑為50μm和75μm的毛細管柱的檢測靈敏度高。采用內徑為100μm的毛細管柱，減少其長度至40cm,對110（111）/147bp標準DNA片段的分離度減少至2.13.因此本實驗選用50cm×100μm i.d.的毛細管進行電泳分離。

2.隨著纖維素質量濃度的增加，對DNA片段的分離能力越好，當膠質量濃度達到8g/L時，110/147bpDNA片段的分離度最大（R=2.91）。繼續增加膠的質量濃度，分離度變化不大，但篩分介質的粘度增大，分析時間延長。故本實驗選用HPMC為8g/L.

3.不同大小的DNA標準片段的遷移時間均隨場強的升高而減小。對于147bp DNA片段，柱效的考察結果顯示，在場強為150V/cm——200V/cm 時具有最高理論塔板數2.3×1O0000.當電場強度高于200V/cm時，遷移時間變短，但焦耳熱效應也較為顯著，從而引起譜帶的展寬，在一定程度上降低了柱效，使分離度降低。為了進行快速分離，我們選用在較高的場強200V/cm下進行電泳分析。

1.遷移時間的重現性

DNA片段遷移時間的重現性是基因分析中的重要指標之一。我們對DAN片段遷移時間的重現性進行了考察，在優化的實驗條件下，對所用的DNA相對分子質量marker和PCR產物連續分析6次，并在待測試樣中加入Sulforhdamine B熒光試劑作為內標物，采用相對遷移時間以消除進樣時間和電壓的波動對遷移時間的影響。在優化的實驗條

件下，對所用的DNA marker分析具有很好的重現性，相對遷移時間的相對標準偏差0.90——1.5.對進口大豆的雙重PCR產物重復測定，其中125bp和142bp DNA片段相對遷移時間分別是0.504和0.526,其相對標準偏差為2.O——3.2 .

2.毛細管電泳與瓊脂糖凝膠電泳的比較

將陽性抗草甘膦轉基因大豆標準、空白對照和進口大豆的雙重PCR產物以及陰性非轉基因大豆的內源基因PCR產物同時用毛細管電泳和瓊脂糖凝膠電泳進行了比較實驗，傳統的瓊脂糖凝膠電泳結果可見，進口大豆和陽性對照的轉基因大豆標準均擴增出2個條帶，分別為125 bp和142 bp;作為陰性對照的非轉基因大豆僅能擴增出內源基因的118 bp條帶;用無菌水作模板的空白對照不能擴增出任何條帶。比較瓊脂糖凝膠電泳與毛細管電泳的結果，兩者基本一致。

毛細管電泳采用上萬伏的高電壓，能更有效地分離差異較小的片段。并能在較短的時間內完成分析。本實驗目標DNA片段在15 min內就可被分離，縮短了分析時問。而瓊脂糖凝膠電泳分離上述兩個片段需要50min.可見，同瓊脂糖凝膠電泳相比，毛細管電泳分析速度更快 毛細管電泳所需的樣品量少。本實驗采用電動進樣，進樣量約5nl,而瓊脂糖凝膠電泳需要5——10μl的上樣量 所以用毛細管進行分析，可以大大節約樣品用量，適合于痕量分析。

凝膠電泳圖譜的條帶一般較寬，不利于DNA片段大小的確定。而毛細管電泳柱效高。峰形尖銳，鑒定能力強。本實驗采用內標與樣品同時電泳，可減少進樣時間和電壓的波動等造成的實驗誤差，提高了結果的準確性。根據DNA Marker和樣品毛細管電泳圖譜，可得DNA片段大小分別為124 bp和145 bp,與測序結果相比較。分別差1 bp和3 hp;圖中峰的DNA片段大小為121bp,與文獻報道的片段大小相比僅差3 bp.由此可見。用毛細管電泳比用凝膠電泳確定DNA片段大小更為準確。

綜上所述，本研究利用雙重PCR技術同時擴增抗草甘瞵轉基因大豆的3種外澡靶基因，只需一次PCR反應就可以準確鑒定出抗草甘膦大豆 采用激光誘導熒光-毛細管電泳分析PCR產物，較傳統瓊脂糖凝膠電罰：相比，縮短了分析時間，分析靈敏度顯著提高，而且樣品用量少 本研究所建立的方法為食品中轉基因成分的快速檢測提供了一個可靠的分析手段。