反相離子對色譜儀分析常用的流動相是甲醇－水、乙腈－水，流動相中一般含有3～10mol/L的離子對試劑。
流動相pH值決定離子化合物的解離度，合適的pH值是反相離子對色譜的重要條件。為了使化合物zui大程度的解離，獲得合適的保留和響應，又不超出硅膠基質色譜柱的承受范圍，一般流動相pH = 2～7.5。
強酸性樣品在低pH值能充分解離，對流動相pH值要求不嚴。對于弱酸性樣品需在高pH值時才能充分解離，若pH值過低，則抑制解離，樣品組分呈不解離溶質，故這些樣品不太適合采用pH值分析。
堿性樣品的分析可控制在較低pH值，能在色譜柱適應的范圍內較方便的進行反相離子對色譜分析。