試劑、試劑盒 RNART主體混合液
儀器、耗材 薄壁PCR管離心管熱循環儀
實驗步驟
一、材料
1.核酸和寡核苷酸
來自方案2的RNA
為每個單獨的H-T11M引物，分別配制RT主體混合液
蒸餾水 28.2ul
5XRT緩沖液 12.0ul
2.5mmol/LdNTP混合液 4.8ul
H-T11M(原文為H-T1M。一譯者改）
引物（這里M=G、A或C)6.0ul
2.專用設備
0.5ml離心管
0.2ml薄壁PCR管（GenHunterT101)
熱循環儀[推薦使用GeneAmpPCRSystem9600(Perkin-ElmerCorporation,Norwalk，CT)或者Mastercycler(EppendorfScientific，Westbury，NY)]
3.附加試劑
RNAspectraFluorescentmRNA差異顯示系統（GenHunterF501-F510R501-R510)，包括蒸餾水、5XRT緩沖液[125mmol/LTris-HCl、pH8.3，188mmol/LKCl,7.5mmol/LMgCl2,25mmol/L二硫蘇糖醇（DTT)]、FDDdNTP混合液(2.5mmol/L)、錨定引物（H-T11M)(2umol/U以及MMLV逆轉錄酶（100U/ul)
二、方法
cDNA合成
1.按照下面步驟，配制3個反應管（為3種H-T11M引物各準備一個）。
各取42.5ulRT主體混合液，加到標記好的、無RNA酶的0.2ml薄壁PCR管中。記住要為所用的每個錨定引物（H-T11M)準備單獨的RT反應！
2.用DEPC處理過的H20,將RNA稀釋到終濃度并充分混勻，置于冰上。
3.取5.0ul稀釋的RNA(0.1ug/ul),加到0.5ml管子中，并充分混勻。
4.按照下面程序設置熱循環儀：65°C 5min→37°C 60min→75°C 5min →4°C平衡。
5.將反應管放到熱循環儀中，開始程序。
6.當反應進行到37°C10min時，暫停熱循環儀，在每個管中加入2.5ulMMLV逆轉錄酶，迅速混勻后繼續溫育。
7.反轉錄結束后，最高轉速短暫離心，收集冷凝水。
8.將反應管放在冰上或-20°C備用。