吖啶橙／溴化乙錠雙熒光染色

AO / EB原理與流程

zhongyisheng:

1、原理：吖啶橙(AO)能透過胞膜完整的細胞，嵌入細胞核DNA，使之發出明亮的綠色熒光。溴乙錠(E僅能透過胞膜受損的細胞，嵌入核DNA，發橘紅色熒光。凋亡的細胞呈現為染色增強，熒光更為明亮，均勻一致的圓狀或固縮狀、團塊狀結構。非凋亡細胞核呈現熒光深淺不一的結構樣特征。二者形態迥然相異，很易判別。在熒光顯微鏡下觀察，可見四種細胞形態：活細胞(VN)，核染色質著綠色并呈正常結構；早期凋亡細胞(VA)，核染色質著綠色呈固縮狀或圓珠狀；非凋亡的死亡細胞(NVN)，核染色質著橘紅色并呈正常結構；晚期凋亡細胞(NVA)，核染色質為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀。

2、AO/EB染色及觀察結果：取 20-100μl的1：100稀釋的染色劑置于載玻片的貼壁細胞上室溫下靜置20min，PBS洗滌2-3遍，上覆蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察結果并計數20-200個細胞。

ym1051:

1、能否提供具體實驗步驟?

2、您在文中所說的"1：100稀釋的染色劑"是怎樣稀釋的?如何在載玻片上種上貼壁細胞?

zhongyisheng:

1、用1mlEP管稀釋時，先取微量的染色劑，然后再取稀釋劑（如BSA）加入EP管吹打即可。

2、消毒滅菌處理后的蓋玻片平放入培養皿或中即可實驗。

ym1051:我好像已明白具體過程了:首先要進行細胞爬片,然后將染色劑滴加在已爬有細胞的蓋玻片上,溫育后洗滌,再蓋上蓋玻片則可進行觀察了.是這樣嗎?如果不經過爬片處理而將細胞進行消化,再將細胞和染色劑滴加在蓋玻片上進行觀察,行嗎?

zhongyisheng: 的確，不經過爬片而是將貼壁細胞消化下來一樣可以進行進一步的實驗。這是懸浮細胞的典型方法。當然，由于進行免疫組化染色進行的形態學檢查經常考慮到細胞的原貌，在國際上比較通用，尤其是在進行動態檢查時。

醫琳師妹：我將我所作的方法與大家共享：

吖啶橙/溴化乙錠雙熒光染色測定PC12細胞凋亡（acridine orange/ethidium bromide, AO/EB）：

（1）細胞爬片：在6孔培養板中預先置入玻璃蓋玻片，接種細胞懸液，干預后，予95%乙醇固定15分鐘，微干，然后準備熒光染色。將100mg/L溶于PBS的吖啶橙和100mg/L溶于PBS的溴化乙錠各5μl（臨用前混合加入，加樣量宜小，有時各2μl-5μl足夠，量太大容易形成細胞凋亡的假陽性），在照相前混勻后加入，輕輕吹打，30秒后用激光共聚焦顯微鏡觀察照相。（有人用15mg吖啶橙溶于100ml pH6.8的PBS中過濾，避光保存）計取5個視野，共100個細胞中凋亡細胞百分數。

（2）如制成細胞懸液：取100μl PBS稀釋的細胞懸液，加2μl的染色液，其中AO/EB，各含100μg/ml，加入染料30秒后觀察攝像。

（有人用PBS配制吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）混合液，各含100μg/ml。細胞離心，懸液于PBS中，取100μl細胞懸液加4μl熒光染色液，輕輕吹打，滴至載玻片上，加蓋玻片后立即置熒光顯微鏡下觀察。）