經典的 Kunfcel 寡核苷酸指導的誘變方法利用大腸桿菌中的尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (glycosylase) 特異地篩除去含尿嘧啶堿基的 DNA 的選擇性作用（請參考寡核苷酸誘變信息欄）。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。
| 試劑、試劑盒 | 緩沖液和溶液乙醇氯化鈉苯酚醋酸鈉TE瓊脂糖凝膠原始的重組 M13 噬菌體單鏈 DNAYT 培養基 |
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| 儀器、耗材 | Corex 離心機管巴斯德滴管柱層析樹脂大腸桿菌菌株 CJ236大腸桿菌菌株 TG1JM109 或相當的菌株 |
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| 實驗步驟 | 材料
緩沖液和溶液
各種貯存液，緩沖液和試劑成分請參閱附錄 1。
將貯存液稀釋至所需的濃度。
乙醇
氯化鈉（2.5mol/L) 含 15% 聚乙二醇（m/V，PEG8000)
苯酚（pH8.0)
苯酚：氯仿（1:1,V/V)
醋酸鈉（3mol/L,pH5.2)
TE(pH7.6)
凝膠
瓊脂糖凝膠
請參閱步驟 16。
核酸和寡核苷酸
DNA 分子質量標準，原始的重組 M13 噬菌體單鏈 DNA
培養基
2xYT 培養基
含 0.25ug/ml 尿嘧啶的 2XYT 培養基
離心機和轉子
SorvallGSA 轉子或相當的產品
SorvallSS-34 轉子或相當的產品
專用設備
Corex 離心機管（15 ml 和 30 ml)
巴斯德滴管
柱層析樹脂
使用預先包裝的樹脂例如 SephacrylS-400(Pharmacia) 或微量制備離心柱（Promega)。
60°C 水浴
其他試劑
本方案步驟 1 需要的試劑已在第 3 章方案 3、4 和 6 中列出。
本方案步驟 6 需要的試劑已在第 3 章方案 1 中列出。
載體和菌株
請參閱附錄 3。
大腸桿菌菌株 CJ236（dut-ung-F')
詳細資料請參閱 Kunkel(1985) 和 Kunkel(1987)。
大腸桿菌菌株 TG1，JM109 或相當的菌株
請參閱步驟 6。
方法
1. 誘變準備
a. 將攜帶靶序列的小片段 DNA(<500bp) 克隆到適當的 M13 噬菌體載體，例如 M13 mp l8 或 mp l9。
b. 從一個由重組噬菌體產生的新生長的噬菌斑中分離單鏈模板 DNA 和雙鏈復制型 DNA。
利用 M13 噬菌體載體進行克隆的方法以及制備單鏈和復制型噬菌體 DNA 的方法請參閱第 3 章方案 3、4 和 6。
c. 限制性內切核酸酶分析復制型 DNA, 單鏈 DNA 序列分析方法鑒定重組克隆的正確性。
Kunkel 過程也可用于從噬菌粒載體產生摻入尿嘧啶的單鏈 DNA(McClary et al.1989 , Wang et al.1989.Liuetal.1990, 綜述文章見 Hagemeier l996)。本文中首先用含有靶序列的雙鏈噬菌粒 DNA 轉化 E.coli CJ236(或其他表型為 dut-ung-F'的菌株）至氨芐青霉素抗性。輔助噬菌體重復感染含靶序列噬菌粒 DNA 的細菌，使噬菌粒 DNA 的復制形式由雙鏈 DNA 轉變成單鏈 DNAs(請參閱第 3 章方案 8）。隨著在尿苷培養基中生長，部分胸腺嘧啶位置上摻入尿嘧啶的單鏈 DNA 被包裝進病毒顆粒并分泌進培養液。分離該 DNA (按步驟 5 所描述的）用作定點誘變的模板（方案 2)。使用噬菌粒載體不需要定點誘變前將起始靶 DNA 克隆進 M13 噬菌體載體。
2. 用滅菌的巴斯德滴管將一個單獨的由重組 M13 噬菌體產生的噬菌斑轉移到含 1 ml 2XYT 培養液的微量離心管中。
3.60°C 孵育 5 min 滅活細菌細胞（殺死細菌細胞防止在下一輪噬菌體繁殖過程中繼續產生含胸腺嘧啶的病毒 DNA 是非常重要的)。劇烈振蕩離心管 30s, 釋放出包裹在頂層瓊脂中的噬菌體。4°C 超速離心 2 min, 以去除死菌體和細胞碎片。
4. 將 50ul 上清液轉移至一個含 50 ml 2xYT 培養液（補充 0.25ug/ml 尿嘧啶）的 500 ml 錐形瓶中。不需要像 Kunkel(1985) 最初描述的那樣補加帶胸腺嘧啶和腺苷的培養液。加人 5 ml 處于對數中期的 E.coli CJ236(dut- ung- F') 培養物。在 37°C 溫度下伴隨劇烈振蕩 (300r/min) 培養 6 h。高效率的通氣培養對噬菌體生長是極為重要的。
用于接種的噬菌體懸液一般為 109 和 1010pfu/ml。處干對數中期的大腸桿菌培養物含大約 5X108 個細菌/ml。病毒感染的低重復性（0.02~0.2pfu/ml) 保證了絕大多數噬菌體是從dut- ung- F'的大腸桿菌菌株中產生的。
5. 在 4°C 溫度下，5000 g(6470r/min，在 Sorvall SS-34 轉子）離心 30 min 收集細胞。將上清液轉移到一個新的適合于 Sorvall GSA 轉子或相當產品的 250 ml 離心瓶中。
6. 測定噬菌體懸液在大腸桿菌菌株 CJ236(dut- ung- F'),JM109 或 TG1 上的相對滴度（請見第 3 章方案 1)。噬菌體在菌株 CJ236 中的滴度應比在 dut+ung+菌株中髙出 4 到 5 個數量級。
為了節省時間，大多數研究人員在獲得滴度測定結果之前就開始純化噬菌體顆粒。然而如果延遲純化，應將噬菌體懸液粗制品置于冰上保存。
噬菌體的產量隨重組體的不同而改變。一般在dut- ung- F'的大腸桿菌菌株（CJ236) 上產生的病毒顆粒上淸液滴度為 5X1010 至 1x1011pfu/ml。然而，生長能力差的重組體可能達到的滴度僅為 1X1010 至 2X1010pfu/ml。如果單鏈 DNA 的產量不足，可經以下兩種途徑補救。
?測定用于感染在 dut-ung—F'大腸桿菌菌株的噬菌體貯存液的滴度。將接種物的體積調節至 0.1pfu/細苗細胞使其有利于重復感染。感染培養物培養 6 h。
?感染培養物生長 12 h 而不是 6 h。如第 5 章屮所述，在延長培養過程中各種缺失體可能比野生型重組體生長速度快，因此最好確證用做模板的單鏈 DNA 大多數分子大小正確。用凝膠電泳分析 M13 噬菌體 DNA 的方法可參閱第 3 章方案 1。
7. 測量噬菌體懸液的體積，然后加入 0.25 倍體積的含 15%(m/V)PAGE 8000 的 2.5mol/L 的氯化鈉，搖晃離心瓶以混勻反應物，將離心瓶置冰上 1h。
8.4°C，5000 g（5500r/min,Sorvall GSA 轉子）離心 20 min 回收沉淀的噬菌體顆粒。以抽真空吸入方式吸去上清液，倒置離心瓶使殘留的上清液完全流出。再用一個連接真空抽氣裝置的滴管吸去滯留在離心管壁上的所有液體。
9. 將噬菌體沉淀物懸浮在 4 mlTE 緩沖液中（pH7.6)。將懸浮液轉移到一個 15 ml 的 Corex 離心管中。再加入 2 ml TE 緩沖液（PH7.6) 清洗離心管壁將洗液合并至 Corex 離心管中。劇烈振蕩懸液 30s, 將離心管置于冰上 1h。
10. 劇烈振蕩噬菌體懸液 30s, 然后 4°C,5000 g(6470r/min,Sorvall SS-34 轉子）離心 20 min 將細菌碎片收集至離心管底部。
11. 小心將獲得的上清液轉移到一個 15 ml 的聚丙烯離心管中，轉移上清液時應不要帶入細菌碎片沉淀物。用苯酚（pH8.0) 抽提懸液 2 次，苯酚：氯仿抽提 1 次。室溫4000 g(5800r/min 用 Sorvall SS-34 轉子）離心 5 min 使各相分離。避免轉移界面物質。
12. 將從最后一次抽提中獲得的水相轉移到玻璃離心管內（例如 30 ml 的 Corex 離心管）。測量溶液的體積，加入 0.1 倍體積的氯化鈉（pH5.2), 苒加入 2 倍體積 0°C 預冷的無水乙醇。徹底混勻內容物，將離心管置于冰上 30 min。
13.4°C,5000 g(6470r/min,Sorvall SS-34 轉子）離心 20 min 回收 DNA。小心去除離心后的上清液。加入 10 ml 室溫保存的 70% 乙醇。稍微旋渦后再離心。
14. 小心吸去上清液，室溫倒置離心管直至乙醇徹底蒸發。將 DNA 溶解在 200ul TE(pH7.6) 緩沖液中。
15. 按附錄 8 描述的方法，用能夠排除大分子 DNA(大于 100 個核苷酸）的離心層析柱純化懸液中含尿嘧啶的單鏈 M13 噬菌體 DNA。
通過離心柱層析純化在dut- ung- F'大腸桿菌菌株中繁殖的單鏈 M13 噬菌體 DNA 以去除其中污染的小分子量的 DNA 和 RNA 寡核苷酸。這些非特異性的寡核苷酸可作為隨后誘變反應中的引物，引起髙背景的假陽性噬菌斑。
16. 用分光光度計在 260nm 波長測量 DNA(1OD260=40ug/ml)(見附錄 8 DNA 定量部分）。用最初的單鏈 M13 重組體 DNA 作為分子量標準，取 0.5ug 上述 DNA 樣品進行凝膠電泳分析 DNA 分子量大小。
17. 按方案 2 所描述的方法進行寡核苷酸定向誘變分析。 |
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