含有目的基因真核表達pEGFPC1載體的構建實驗_質粒提取

質粒提取試劑盒限制性核酸內切酶

離心機振蕩培養箱電泳裝置冰盒恒溫水浴箱

1.  挑取含有目的DNA重組體的單個菌落接種在3 ml LB（含有Amp或Kan）液體培養基中，37 ℃，225 rpm培養12～16 hrs。

2.  提取質粒

⑴離心菌液，廢棄上清。

⑵加入250 ul Buffer P1，使菌片重懸，務必使片狀物不可見。

⑶加入250 ul Buffer P2，上下顛倒EP管4～6次，操作時間要少于5 min。

⑷加入350 ul BufferN3，上下顛倒EP管4～6次，可見絮狀沉淀。

⑸離心13000 rpm，10 min。

⑹離心后的上清液移入PrepSpinColumn。

⑺13000 rpm離心30～60Secs，棄濾液。

⑻加入0.5 mlBufferPB，13000 rpm離心30～60 Secs，棄濾液。

⑼加入0.75 mlBufferPE，13000 rpm離心30～60 Secs，棄濾液。

⑽13000 rpm再離心1 min，棄濾液。

⑾將PrepSpinColumn加到新的1.5 mlEP管上。

⑿加50 ul BufferEB至濾膜中央，室溫靜置1 min，13000 rpm離心1 min。即獲得所需質粒。

3.  酶切鑒定

反應體系（20 ul 體系）：
 

反應條件：37 ℃ 2-3 hrs

4.  電泳：觀察酶切結果。