（1）在噬菌體展示過程中必須經過細菌轉化、噬菌體包裝，有的展示系統還要經過跨膜分泌過程，這就大大限制了所建庫的容量和分子多樣性。目前，常用的噬菌體展示文庫中含有不同序列分子的數量一般限制在10。
（2）不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達，因為有些蛋白質功能的實現需要折疊、轉運、膜插入和絡合，導致在體內篩選時需外加選擇壓力。例如，在噬菌體展示文庫試驗中，由于部分未折疊的蛋白在細菌中很容易被降解，因此，必須小心控制條件，以保證在噬菌體表面展示的文庫沒有降解。另外，鼠源抗體在噬菌體中表達差，也是體內選擇壓力的一個例子。真核細胞蛋白在細菌中表達差是因為它們的蛋白質合成與折疊機制不同的緣故 。
（3）噬菌體展示文庫一旦建成，很難再進行有效的體外突變和重組，進而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。
（4）由于噬菌體展示系統依賴于細胞內基因的表達，所以，一些對細胞有毒性的分子如生物毒素分子，很難得到有效表達和展示。