噬菌體文庫的鋪平板和轉移實驗

噬菌體

瓊脂糖 LB NaOH SSC Tris·Cl

硝酸纖維素膜 培養箱

1.  通過系列等比稀釋滴定噬菌體文庫的滴度。

2.  重組噬菌體與鋪平板的宿主菌混合于培養試管中（表一），于37 ℃溫育20 min。
 

表一、噬菌體文庫鋪平板組分最佳配制方法

3.  按每個平板的噬菌體數決定篩選文庫時將用到的平板數。

4.  該數目取決于文庫中重組噬菌體的數目和目的克隆出現的概率。

5.  在試管中加入0.7%頂層瓊脂糖，并迅速傾倒在37 ℃保溫的LB上平板上，37℃培養約6~12 h，至噬斑布滿平板，但大小適當互不相連。

6.  平板置于4℃1 h以上方可用于濾膜影印實驗。

7.  用原珠筆在硝酸纖維濾膜上做好標記，標記面朝上。

8.  將濾膜覆蓋在預冷的長有噬斑的LB平板上1~10 min 用20-G針頭穿刺標明定位方向后。

9.  用平頭鑷子取出濾膜，面朝上輕放在紙巾或濾紙上，室溫晾干10 min 以上。

10.  接著，濾膜轉印面朝上，依次放在3張分別飽蘸下面3種液體的Whatman 3 MM 濾紙上，各1~2 min。

（1）0.2 mol/l NaOH / 1.5mol/l NaCl

（2）0.4 mol/l Tris·Cl pH7.6 / 2×SSC

（3）2×SSC

10.  將濾膜置于真空烤箱中80℃干烤90~120 min，或者置于42℃的恒溫箱中過夜，若暫不做雜交實驗，濾膜可用干燥的濾紙夾好，室溫保存。