噬菌體DNA在濾膜上的雜交實驗

噬菌體 DNA 放射性標記探針

氯仿 預雜交液 SM SSPE

煮沸的水浴 玻璃（Pyrex ) 烘烤平皿或其他雜交器皿 膠水 培養箱 放射性墨 Whatman 3 MM 紙

一、材料

1. 緩沖液和溶液

氯仿

預雜交液

SM

2X SSPE

洗液 1（2X SSC，0.1% (m/V) SDS）

洗液 2（1X SSC，0.1% (m/V) SDS）

洗液 3（0.1X SSC，0.1% (m/V) SDS）

2. 核酸和寡核苷酸

固定于膜上的噬菌體 DNA

放射性標記探針

3. 專用設備

煮沸的水浴（用于雙鏈探針變性）

玻璃（Pyrex ) 烘烤平皿或其他雜交器皿



膠水，水溶性（如 FaberCastell 公司的 UHU Stic)

預置于適宜雜交溫度的培養箱

放射性墨

Whatman 3 MM 紙

二、方法

1. 如果濾膜是干的，將經烘烤或交聯的濾膜漂浮在 2X SSPE 表面，直到自下而上完全濕透，再將濾膜浸沒 5 min。

2. 將濾膜轉移至含有預雜交液的 Pyrex 平皿或其他雜交器皿中，每張 82 mm 濾膜用 3 ml 預雜交液或每張 132 mm 濾膜用 5 ml 預雜交液。將濾膜置搖床中于適宜的溫度下（即在水溶液中雜交為 68℃，在 50% 的甲酰胺溶液中雜交則為 42℃）溫和地振搖 1~2 h 或更長。

3. 通過 100℃ 加熱 5 min 變性 ³²P 標記的雙鏈探針，然后置冰水浴快速冷卻，而單鏈探針不需要變性。



4. 將變性探針加入至浸泡了濾膜的預雜交液中，在適宜的溫度下溫育 12~16 h。

5. 當雜交完成后，將濾膜快速從雜交液中取出，立即浸入放置于室溫的大體積（300~500 ml ) 洗液 1 中。輕輕晃動濾膜，且在清洗過程至少翻動一次。5 min 后，轉移至新鮮的洗液中，繼續輕輕晃動。再重復漂洗過程兩次。

6. 在 68℃ 于 300~500 ml 的洗液 2 中漂洗兩次，時間為 1~1.5 h。

7. 將濾膜置于 Whatman 3 MM 濾紙或紙巾上，在室溫風干。在濾膜的背面貼上水溶性膠水，然后排列在一張干凈、干燥、平整的 3 MM 濾紙上（編號的一面朝上），并用力壓濾膜，使其粘在濾紙上而無法移動。在 3 MM 濾紙上選數個非對稱的點，滴上放射性墨汁或化學發光標記。這些標記被用于對齊放射自顯影與濾膜。用 Saran 公司的包裝膜（Wrap/Cling Film) 蓋住濾膜和標記。用膠帶將包裝膜在 3 MM 濾紙的背面封住，將濾紙上的包裝膜拉直，防止起皺。

8. 將濾膜進行 X 射線片（Kodak 公司 XAR-2、XAR-5 或相當產品）曝光，帶增感屏 -70℃ 曝光 12~16 h。

9. 將 X 射線片顯影，根據放射性墨汁或化學發光標記與濾膜對齊，然后用非放射性的紅色纖維尖頭筆在 X 射線片的相應位置標上對應于編號濾膜的非對稱性點。

10. 通過與瓊脂平板上方向標記的比對找到陽性克隆。

11. 挑取陽性克隆，并保存于含 1 滴（50 μl ) 氯仿的 1 ml SM 中。

12. 為了純化雜交陽性的噬菌斑，將從扣取瓊脂塊上回收到的噬菌體組分（通常為 50 μl 10^-2 稀釋液）鋪平板培養，隨后進行新一輪的雜交篩選。