1、吸附法
利用各種吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和離子吸附法。
常用吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。
采用吸附法固定酶，其操作簡便、條件溫和，不會引起酶變性或失活，且載體廉價易得，可反復使用。
2、載體結合法
最常用的是共價結合法，即酶蛋白的非必需基團通過共價鍵和載體形成不可逆的連接。在溫和的條件下能偶聯的蛋白質基團包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基。參加和載體共價結合的基團，不能是酶表現活力所必需的基團。以中國首先采用的雙功能團試劑“對位-β-硫酸酯乙砜基苯胺”偶聯載體和酶為例，載體結合的步驟如下頁反應式。
此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。此外酶通過物理吸附或離子吸附于載體制備固定化酶也是常用的方法。
3、交聯法
依靠雙功能團試劑使酶分子之間發生交聯凝集成網狀結構，使之不溶于水從而形成固定化酶。常采用的雙功能團試劑有戊二醛、順丁烯二酸酐等。酶蛋白的游離氨基、酚基、咪唑基及巰基均可參與交聯反應。
4、包埋法
酶被裹在凝膠的細格子中或被半透性的聚合物膜包圍而成為格子型和微膠囊型兩種。包埋法制備固定化酶除包埋水溶性酶外還常包埋細胞，制成固定化細胞，例如可用明膠及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌體，可連續水解帤基青霉素，工業生產6-氨基青霉烷酸。
酶經過固定化后，比較能耐受溫度及pH的變化，最適pH往往稍有移位，對底物專一性沒有任何改變，實際使用效率提高幾十倍（如5′-磷酸二酯酶的工業應用）甚至幾百倍（如青霉素酰化酶的工業應用）。