固定化酶的研究與應用

固定化酶（immobilized enzyme)是20世紀60年代發展起來的一種新技術。所謂固定化酶，是指在一定的空間范圍內起催化作用，并能反復和連續使用的酶。通常酶催化反應都是在水溶液中進行的，而固定化酶是將水溶性酶用物理或化學方法處理，使之成為不溶于水的，仍具有酶活性的狀態。

酶固定化后一般穩定性增加，易從反應系統中分離，且易于控制，能反復多次使用。便于運輸和貯存，有利于自動化生產，但是活性降低，使用范圍減小，技術還有發展空間。固定化酶是近十余年發展起來的酶應用技術，在工業生產、化學分析和醫藥等方面有誘人的應用前景。

固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世紀60年代,70年代已在全世界普遍開展。酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固體材料將酶束縛或限制于一定區域內,仍能進行其特有的催化反應、并可回收及重復利用的一類技術。與游離酶相比,固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應特性的同時,又克服了游離酶的不足之處,呈現貯存穩定性高、分離回收容易、可多次重復使用、操作連續可控、工藝簡便等一系列優點。固定化酶不僅在化學、生物學及生物工程、醫學及生命科學等學科領域的研究異常活躍,得到迅速發展和廣泛的應用,而且因為具有節省資源與能源、減少或防治污染的生態環境效應而符合可持續發展的戰略要求。

固定化酶與水溶性酶相比的優缺點

優點：固定化酶可重復使用，使酶的使用效率提高、使用成本降低。

固定化酶極易與反應體系分離，簡化了提純工藝，而且產品收率高、質量好。

在多數情況下，酶經固定化后穩定性得到提高。

固定化酶的催化反應過程更易控制。

固定化酶具有一定的機械強度，可以用攪拌或裝柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反應的連續化和自動化操作。

固定化酶與游離酶相比更適于多酶體系的使用，不僅可利用多酶體系中的協同效應使酶催化反應速率大大提高，而且還可以控制反應按一定順序進行。

缺點：固定化可能造成酶的部分失活，酶活力有損失。

酶催化微環境的改變可能導致其反應動力學發生變化。

固定化酶的使用成本增加，使工廠的初始投資增大、

固定化酶一般只適用于水溶性的小分子底物，對于大分子底物不適宜。

與完整菌體細胞相比，固定化酶不適宜于多酶反應，特別是需要輔助因子參加的反應。

胞內酶進行固定化時必須經過酶的分離純化操作。

固定化細胞和固定化酶比較,2個的優缺點

固定化細胞：優點： 固定化細胞內酶的活性基本沒有損失。缺點： 固定化細胞只能用于生產細胞外酶.固定化酶：優點：容易與水溶性反應物和產物分離。.缺點： 一種酶只催化一種化學反應,而產物形成是通過一系列酶促反應得到的.

制備方法

分類

制備方法分類圖

固定化酶的制備方法有物理法和化學法兩大類。

物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的優點在于酶不參加化學反應,整體結構保持不變,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空間或立體阻礙作用,因此對一些反應不適用。

化學法包括結合法、交聯法。結合法又分為離子結合法和共價結合法。是將酶通過化學鍵連接到天然的或合成的高分子載體上,使用偶聯劑通過酶表面的基團將酶交聯起來,而形成相對分子量更大、不溶性的固定化酶的方法.

其中吸附法和共價鍵法又可統稱為載體結合法。

具體方法

吸附法

利用各種吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和離子吸附法。

常用吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。

采用吸附法固定酶，其操作簡便、條件溫和，不會引起酶變性或失活，且載體廉價易得，可反復使用。

載體結合法

最常用的是共價結合法，即酶蛋白的非必需基團通過共價鍵和載體形成不可逆的連接。在溫和的條件下能偶聯的蛋白質基團包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基。參加和載體共價結合的基團，不能是酶表現活力所必需的基團。以中國首先采用的雙功能團試劑“對位-β-硫酸酯乙砜基苯胺”偶聯載體和酶為例，載體結合的步驟如下頁反應式。

此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。此外酶通過物理吸附或離子吸附于載體制備固定化酶也是常用的方法。

交聯法

依靠雙功能團試劑使酶分子之間發生交聯凝集成網狀結構，使之不溶于水從而形成固定化酶。常采用的雙功能團試劑有戊二醛、順丁烯二酸酐等。酶蛋白的游離氨基、酚基、咪唑基及巰基均可參與交聯反應。

包埋法

酶被裹在凝膠的細格子中或被半透性的聚合物膜包圍而成為格子型和微膠囊型兩種。包埋法制備固定化酶除包埋水溶性酶外還常包埋細胞，制成固定化細胞，例如可用明膠及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌體，可連續水解帤基青霉素，工業生產6-氨基青霉烷酸。

酶經過固定化后，比較能耐受溫度及pH的變化，最適pH往往稍有移位，對底物專一性沒有任何改變，實際使用效率提高幾十倍（如5′-磷酸二酯酶的工業應用）甚至幾百倍（如青霉素酰化酶的工業應用）。

固定化酶的應用

酶工程作為生物工程4個組成部分之一，已廣泛應用于工業生產中的食品、醫藥、紡織等部門，但天然酶穩定性低，對高溫、有機溶劑極其敏感，易失活，不能重復使用，反應后混入產品，使產品難以純化。而通過物理或化學的方法，將酶固定于載體上，所得的酶不僅保留了酶原有的高活性、高選擇性，并且克服了天然酶的缺點，還便于反應的連續化和自動化。因此，固定化酶已經成為近代酶工程領域中主要的研究內容之一。固定化酶較高的穩定性，使其在工業生產中有廣闊的前景。

食品工業

罐裝液態茶飲料自20世紀80年代開發成功以來已迅速發展成為當今國際飲料市場的主流產品之一。增香和除混是制約茶飲料發展的2個重要因素。將單寧酶和β-葡萄糖甘酶進行共固定化，并以綠茶、紅茶、烏龍茶為例研究了共固定化酶的性質，結果表明：經共固定化酶處理后，綠茶、紅茶、烏龍3類茶的香精油總量均有所增加；3類茶的非酯型兒茶素含量增加，而酯型兒茶素的含量下降。

燃料工業(生物柴油)

生物柴油主要是以植物油和動物油為原料而制成的，其主要優點是：生物可降解性、可再生資源、無毒、廢氣排放量小，是環境的友好燃料，可作為石油的替代品。目前生產生物柴油主要采用化學法。此方法工藝復雜、能耗高、產品易變質、生產過程有污染，因此，已經有學者研究利用生物酶法，即動植物油脂和低碳醇通過脂肪酶進行酯化反應，制備相應的脂肪酸酯。脂肪酶廣泛地應用于生物柴油工業。等研究了利用多孔滲水物質為載體固定脂肪酶，使其可在低水環境中合成生物柴油。

醫藥工業

現代制藥也大多采用化學方法，但化學法工藝復雜，原料浪費嚴重且易產生污染，因此人們漸漸轉向生物酶法制藥的研究，獲得了很多可喜的成果。頭孢菌素正漸漸代替青霉素成為臨床應用上主要的抗生素。梅建鳳等利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢羥氨芐，并選擇了較好的合成工藝，使此反應的轉化率可達到80.3%