固相化金屬親和層析法純化蛋白質實驗

固相化金屬親和層析的原理是利用暴露的蛋白質殘基和介質上的金屬離子之間的相互作用進行純化。作為電子供體的表面氨基酸，特別是甘氨酸，與金屬離子螯合時，在金屬親和柱內含這些氨基酸殘基的蛋白質就受到阻滯。由于電子供體一定是未質子化的，至少部分是如此以便螯合金屬離子，所以越堿性的溶液蛋白質與金屬親和柱結合越強。

為了能和蛋白質相互作用，固相化的金屬離子必須是易于接近的。這種可接近性是這樣實現的。從介質伸出一些親水的臂，其末端與金屬形成復合物。市售的、典型的用于金屬螯合的介質是亞氨基乙酸（IDA）。當需要更緊的蛋白質－金屬結合時，羧甲基乙二胺（TED）Sepharose 也是可以用的。如果幾乎沒有關于將要純化蛋白質特性的信息，則銅是首選試用于金屬親和柱的金屬。常用的其他金屬有鎳、鋅、鈷和鈣。沒有一個現成的方法可以用于選擇最佳金屬離子，只能推薦反復試驗篩選。在金屬親和層析過程中，應用高鹽溶液（0.5～1 mol/L NaCl） 可以減少非特異離子相互作用。此外，在蛋白質結合前和過程中定要避免金屬螯合劑（EDTA、EGTA 和檸檬酸鹽）。

蛋白質樣品液

五水硫酸銅磷酸鈉鹽緩沖液NaClEDTA

層析柱

1. 10 ml IDA－Sepharose 6B 裝填一個柱子。柱長與柱徑比例可隨目的蛋白結合的緊密程度不同而變化。結合較緊的目的蛋白用短而粗的柱子就能很好地分離；

2. 3 倍柱床體積的水洗柱；

3. 3 倍柱床體積的 1mg/ml CuSO₄·5H₂O 洗柱；

4. 5 倍柱床體積的層析緩沖液（20 mmol/L，pH 7.5 磷酸鈉鹽緩沖液，0.5 mol/L NaCl）洗柱；

5. 用層析緩沖液處理蛋白質樣品液，即用該緩沖液透析或 1：1 稀釋。再經離心或過濾獲得澄清的樣品液。介質結合容量決定柱子的有效載樣量，通過試驗測定柱子的總結合容量是非常有用的。通常結合容量的合理估計是每 ml 介質結合 10～100 mg 蛋白質；

6. 將樣品液（蛋白質濃度 1～10mg/ml）上樣到金屬親和柱；

7. 5 倍柱床體積層析緩沖液洗柱，或洗至 A₂₈₀ 值回到甚線；

8. 5 倍柱床體積洗脫緩沖液（100 mmol/L，pH 5.0 乙酸鈉，0.5 mol/L NaCl）洗脫目的蛋白；

9. 含 50 mmol/L EDTA 的層析緩沖液既可用于洗脫較強結合的蛋白質，也可用于柱子的再生。

另一個洗脫策略是金屬結合競爭法，例如增加咪唑、組氨酸、甘氨酸或氯化銨的濃度，從而與目的蛋白競爭金屬離子結合位點達到洗脫目的。促溶劑（脲）或去垢劑也有助于強結合蛋白質的洗脫。

濃度梯度洗脫也可試用來代替上面介紹的洗脫步驟。