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  • 發布時間:2019-03-28 21:30 原文鏈接: 固相化pH梯度雙向凝膠電泳實驗9

    方案9 膠體考馬斯亮藍染色實驗

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    • 固相化 pH 梯度雙向凝膠電泳實驗

    • 標簽:

      雙向凝膠電泳

      蛋白質 固相化pH 蛋白質與蛋白質組學實驗指南 第四章




      雙向電泳是研究蛋白質組學的一種有效方法。與單向電泳相比,它能從復雜的蛋白質混合物中分離出更多的成分。電泳時,蛋白質遷移速度取決于它們的分子形狀、大小及所帶電荷多少,雙向電泳利用后兩項特征使蛋白質能夠有效分離。

      [澳] 理查德 J. 辛普森 (Richard J.Simpson) 主編 何大澄 主譯


    • 方案1 雙向凝膠電泳鼠肝蛋白質提取物的制備實驗

    • 方案2 雙向凝膠電泳真核生物細胞裂解物的制備實驗

    • 方案3 雙向凝膠電泳大腸桿菌裂解液的制備實驗

    • 方案4 雙向凝膠電泳腦脊液蛋白樣品的制備實驗

    • 方案5 第一向:蛋白質的等電聚焦電泳實驗

    • 方案6 垂直 SDS 平板凝膠的制備:均一凝膠的灌制實驗

    • 方案7 垂直SDS 平板凝膠制備:同時灌制多梯度凝膠實驗

    • 方案9 第二向:蛋白質的 SDS-PAGE 實驗

    • 方案10 膠體考馬斯亮藍染色實驗

    • 方案11 銀氨染色

    • 方案12 與質譜兼容的銀染法實驗

    • 方案13 用 SYPRO Ruby 進行熒光染色

    • 方案14 用 GelCode 磷蛋白染色試劑盒對磷蛋白進行染色實驗

    • 方案15 雙向凝膠的槽式轉移實驗

    • 方案16 雙向凝膠的半干印跡實驗

    • 方案17 用麗春紅 S 染色膜上的蛋白質

    • 方案18 用考馬斯亮藍 R250 染色膜上的蛋白質

    • 方案19 用印度墨水染色膜上的蛋白質

    • 方案20 用膠體金染色膜上的蛋白質

    實驗方法原理此方案是在對 Neuhoff 等的方法進行修訂的基礎上建立的(1988),包括考馬斯亮藍 G250 和蛋白質的結合。考馬斯亮藍 G250 可以結合堿性氨基酸如精氨酸、酪氨酸、賴氨酸和組氨酸,染料的膠體特性使產生的背景非常低。這一特性可以阻止考馬斯亮藍滲透凝膠,避免考馬斯亮藍 R250 染色時較長的脫色過程。膠體考馬斯亮藍通常用于染色凝膠,檢測范圍為 8~50ng。
    實驗材料

    包含蛋白質樣品的凝膠

    試劑、試劑盒

    考馬斯亮藍染料儲備溶液固定液甘油甲醇

    儀器、耗材

    玻璃平皿或塑料平皿往復式或定軌式搖床

    實驗步驟

    1.將凝膠置于玻璃或塑料培養皿中固定,輕輕搖動至少 1h。

    可將凝膠固定過夜。如果凝膠有標記,多個凝膠可在同一培養皿中固定,固定液的體積應足夠大,以使所有凝膠都能自由移動。

    2.移走固定液,在搖床上用水清洗凝膠 10 min。

    3.棄去水,重復洗 2 次。

    4.在洗第三次時,將 4 份考馬斯亮藍儲備液和 1 份甲醇混合,以制備膠體考馬斯亮藍染液。

    5.將凝膠放在 100~300 ml 膠體考馬斯染料內(染料的體積依膠的大小而定,確保染料覆蓋凝膠)。在往復式或定軌式搖床上,輕搖過夜。

    凝膠應在染料中放置足夠長時間,其顏色會持續加深一直到第七天。

    6.去除殘留染料,將凝膠轉移至盛有 45~55°C 雙蒸水或去離子水的干凈平皿中。

    當水變色時棄去,再次用新的 45~55℃的 H2O 輕輕搖晃清洗凝膠。重復幾次,直到蛋白質帶較凝膠背景變得明顯,蛋白質將在清晰的背景上出現藍色。

    7.凝膠可用于掃描分析。掃描濕凝膠較好,因為若凝膠干燥易破裂,導致數據的丟失。

    8.在干燥之前,將凝膠浸在 5% 甘油中 30 min,凝膠也可裝在密封塑料袋內,儲存于 4°C。

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