打開循環水浴，設置冷卻溫度，一般為 10℃。
將制好的固相 pH 梯度凝膠鋪在冷卻板上，注意正負極。其間涂以液體石蠟或煤油，避免氣泡陷入，以保證膠板和冷卻板之間的良好接觸。
用合適的電極溶液（參見表 7.7) 潤濕濾紙電極條，分別放置凝膠的酸、堿側。有的儀器采用粗電極與凝膠直接接觸，不需加電極條。
按冷卻板上的格子和預先設計的實驗計劃將樣品加在凝膠上。微量樣品可直接滴加，稀樣品加在濾紙塊上或小槽中。固相 pH 梯度等電聚焦與載體兩性電解質等電聚焦的樣品處理方法相似，只是前者 pH 梯度已在凝膠中固定，所以樣品中的鹽對梯度影響不大，但過高的鹽濃度也會造成凝膠電導的降低而燒膠或使譜帶畸變。
將白金電極絲分別放在濾紙電極條的中心，再將陽極和陰極分別與電源的正、負極相連。接通電源，電參數參見表 7.8。
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