GFP蛋白曾經為蛋白質定位等相關研究帶來革命性的進展，而隨著具有和GFP類似遺傳學特征的光學指示劑蛋白的出現，蛋白質相關的動態研究也將獲得更多的手段和技術，本文詳細介紹了激光誘導熒光系統在蛋白質研究中的應用。
近年來隨著蛋白質學研究的進展，研究人員相繼發現和特異克隆了一些特殊蛋白質。這些蛋白具備和GFP（green fluorescence protein，綠色熒光蛋白）類似的遺傳學特征，可以質粒方式轉染或共轉染到細胞中，隨后可以獨立表達或和其融合的蛋白一起表達，并幾乎對其標記蛋白的功能和定位沒有任何影響。這些蛋白的另外一個顯著的特點是其在特殊的激光刺激下會產生一些特異性的變化，如亮度變化、顏色變化等。隨著這些蛋白的產生，一些以往難以操作，甚至不能完成的科學研究已經變為可能。這些研究包括：熒光團、熒光抗體和GFP融合蛋白等標記的膜成分擴散運動；膜蛋白及脂質成分研究；亞細胞膜；脂質重建；細胞質內擴散運動；胞間信息交換；檢查內質網、細胞核和細胞質等區室邊界等。
根據其引發變化不同，激光誘導相關研究可以大致分為兩大類，一類是通過改變熒光染料熒光亮度來實現，包括光漂白和光活化，其中光漂白主要有FRAP（Fluorescence Recovery After Photobleach）和FLIP （Fluorescence Loss In Photobleach）兩種技術，光活化以PA-GFP/ Dronpa/ uncaging為代表；另一類是是通過改變熒光染料顏色實現，主要是以Keade為代表的光轉化。
光漂白后恢復FRAP
光漂白后恢復（FRAP，Fluorescence Recovery After Photobleach）經常用于分析多種生物膜系統。FRAP是用較強的激光將微米大小區域的熒光完全漂白，在被漂白區和未漂白區之間形成明顯熒光亮度反差，隨后研究者可以持續觀察兩個區域之間的相互運動。只有漂白區和未漂白區熒光分子之間存在交互擴散運動，光漂白區才能重新出現熒光，通過分析漂白區域的熒光變化可以推測出膜蛋白的動力學特性。
FRAP結果表明，多數膜蛋白并不是在胞質或質膜上的隨意擴散，生物膜上蛋白質的擴散存在許多限制條件，主要包括：膜分子之間、膜分子與胞質及胞外基質分子之間的相互作用。對于特定蛋白分子來說，其運動狀態和組分體現了細胞骨架、細胞質、脂雙層的粘度和其他膜蛋白對它的綜合限制作用。利用FRAP技術定量研究分子運動的物理性限制作用，將有助于我們更深入地了解細胞內蛋白質和脂類分子的特性、相互作用甚至生理功能。
熒光漂白消失FLIP
一些標本或標本的不同部位如：細胞核膜、內質網和細胞質等，熒光恢復的速度非常快，熒光漂白與恢復幾乎同時發生。而使用FRAP實現微觀動力學的過程中，必須分為漂白和漂白后兩個過程，兩個過程之間的轉換存在時間延遲，所以FRAP實驗無法實現這些快速變化標本的動力學研究。熒光漂白消失（FLIP，Fluorescence lose in Photobleach）與FRAP類似，同樣在細胞上選取局部刺激區域，用強激光反復刺激，不同之處是FRAP記錄的是被漂白區域的熒光恢復過程，而FLIP記錄的是未被漂白區域的熒光損失過程，該技術為檢查內質網、細胞核和細胞質等區室的邊界提供了強有力的工具。
FLIP技術要求提供盡量同步的刺激圖像獲取，現有絕大多數設備無法滿足甚至接近該要求。2004年底OLYMPUS公司新開發的FV1000光誘導系統采用了突破性SIM（同步）技術，分離出一束與取圖激光獨立的激光照明系統，可以在取圖的同時對標本特定部位進行刺激，無須切換XY掃描振鏡的掃描模式，可以真正實現同時刺激，同時觀察變化。避免了傳統使用共聚焦顯微鏡必須在局部刺激掃描和整體動態圖像獲取之間的反復切換的時間延遲和低刺激效率。同時其刺激激光采用了短光路和龍卷風掃描模式，極大地提高了光漂白的效率。
光學誘導熒光蛋白
發現熒光蛋白并利用基因工程對這些蛋白進行重組和優化后，擴展了生物學家的研究手段，他們可以在更廣泛的空間和時間分辨率內對活細胞進行觀察，并可以進行細胞內分子追蹤、分子定量等研究，從而可以分析活細胞中蛋白質分布、運動、衍生物情況和生物化學特性。蛋白質功能研究已經被公認為繼測定基因組序列之后最重要的細胞活動研究重點。
下面將以三個典型的光誘導蛋白為例說明其獨特的光學性質和其非常適合生物學研究的特征。
光活化熒光蛋白PA-GFP
第一個被設計用于光活化研究的光學指示劑是一種Aequorea victoria 水母的蛋白突變體，叫做PA-GFP（分別取photo和activatable的首字母）。這種GFP蛋白的光活化突變體是將野生型中性蛋白質改造為陰離子態得來的。在穩定狀態（unperturbed state）時，野生型綠色熒光蛋白在395和475nm處分別有一大一小兩個吸收峰。當用強紫外或紫光照射該蛋白時，發色團產生光轉化，從而改變了大小兩個吸收峰的相對消光系數的比值。結果是在488nm激發下，發射熒光的強度比未刺激前增加了3倍。
圖1. 由上至下分別為FRAP、FLIP、光活化。
通過突變技術的PA-GFP降低了475nm處的吸收峰，在450~550nm處的吸收幾乎可以忽略不計，同時增強近紫外（約400nm）照射下野生型光轉化效率。因此極大增加了非活化和活化狀態之間的反差。光活化后，PA-GFP在504nm處的最大吸收增加了約100倍。這一現象極大增強了轉化和未轉化PA-GFP之間的差異，以此可以最終觀察其在細胞內的動態變化（見圖2）。
圖2. 三種典型光誘導蛋白。
圖3a顯示了光活化前后的PA-GFP吸收和發射峰曲線。圖中標明了用于光轉化的激光波長（箭頭所示）和寬場弧光燈激發波段（黃色框）。圖3a中的活化后熒光發射曲線是在488nm激光激發下得到的。用405nm固體激光器可以激發目的位點，如圖3b所示。光活化后，綠色發射熒光的強度會明顯上升，如圖3c所示。
圖3. PA-GFP譜線和光活化特性。
PA-GFP的光活化可以用來標記選定分子或整個細胞，并利用延時圖像技術獲取動力學特征。在理想狀態下，只有活化的PA-GFP分子發射醒目的熒光，新合成的蛋白不會對實驗造成影響。PA-GFP的光活化會比利用GFP進行光漂白研究的速度更快、現象更明顯，而且用于光活化的激光強度要遠小于FRAP的漂白激光，對細胞的殺傷相對較低。因此該項技術非常適合活細胞中蛋白質的動態研究。
但需要注意的是在光轉化后，PA-GFP和野生型GFP熒光在488nm激發下都會表現同樣水平的增強。但從另一方面講，在未被光誘導（如405nm激發）前很難區分細胞是否表達PA-GFP，所以用顯微鏡很難提前確定確切的表達區域。
可擦寫光學蛋白Dronpa
從Pectiniidae（一種石化珊瑚蟲）中提取的單體熒光蛋白Dronpa 預示了新一代的可開關特殊熒光蛋白的誕生。Dronpa表現出了與眾不同的光變色性能，它可以用兩種不同的激發光控制熒光的開和關。
Dronpa熒光蛋白驚人的特點是可以在488nm下快速漂白，并且隨后又可以在405nm激發光刺激下完全恢復。這種模式的光漂白和活化可以反復進行。
圖4顯示了轉基因細胞中Dronpa蛋白在光漂白和光活化之間的可逆轉換。該細胞被轉染了只含有Dronpa蛋白基因（沒有其他融合基因）的質粒并在細胞培養瓶中培養。最初在488nm下標本顯示很明亮的綠色熒光（圖4，0s），50~60s后亮度逐漸衰減（圖4，0~55s）至檢測不到。熒光衰減曲線如圖4a中綠色曲線所示。用405nm近紫外激光活化后，Dronpa 蛋白的熒光強度恢復（圖4，紫色曲線）。同樣方法反復光漂白和活化重復10次以上的圖形（圖4b）顯示，多次反復后Dronpa熒光的恢復會有一定的衰減。10次循環后，Dronpa 熒光減少為原來的88%左右。
圖4. Dranpa蛋白的光學特點。
光誘導變色熒光蛋白KEADE
目前已經從珊瑚蟲和海葵中提取和開發出了許多有應用潛力的光學指示劑。其中一個非常重要的是Kaede蛋白，受紫外激發后這種蛋白會產生從綠色到紅色的光轉化。光轉化后，紅/綠比會顯著增加約2000倍（紅增、綠減）。這一類具有獨特顏色轉換特性的光學指示劑會成為亞細胞器乃至整個細胞光學標記的最佳選擇。
圖5顯示的是光轉化前后Kaede 蛋白的吸收、發射光譜曲線和細胞中兩種顏色熒光融合的動態圖像。分別用綠色的虛/實線代表轉化前Kaede蛋白的吸收/發射曲線，用紅色虛/實線代表轉化后Kaede 蛋白的吸收和發射曲線。由圖可以看出，經過光誘導后紅和綠兩個熒光發射峰之間的差異非常明顯，發射峰值距離約為60nm。圖5a到圖5d數碼圖像為我們展示了光轉化前Kaede的綠色熒光，見圖5a，用405nm激光對選擇區域進行短時間激發，如圖5b中紅色部分所示，轉化后Kaede蛋白逐漸擴散到整個細胞但沒有進入細胞核的動態圖像，見圖5c和圖5d。
圖5. Keade蛋白的光譜特征和光轉化特點。
利用Keade蛋白在光轉化前后的明顯顏色變化，研究者可以持續追蹤紅色熒光的動態變化，進而描述出其標記的動力學特征。利用這種顯著的顏色差異，這種蛋白還更多的被用于區分特異細胞和周圍類似細胞的實驗中。
實驗操作要求
在光轉化和光活化實驗中，選擇感興趣區域進行刺激的比較理想的操作方法是使用生光調制器（acousto-optic tunable filter，AOTF），用它可以非常方便地定義圓形、橢圓、方形和其他自由形狀區域對標本進行光刺激。
但使用共聚焦和AOTF方法研究光轉化或光活化反應存在重要缺陷：刺激和取圖要共用同一對XY掃描振鏡，所以刺激和掃描只能分開在不同時間段進行。這樣操作存在幾個弊端：第一，刺激的同時無法觀察細胞反應；第二，無法確定細胞確切的受誘導狀態，經常需要在刺激和取圖之間反復切換，以獲取最佳的誘導狀態；第三，由于在AOTF/ZOOM誘導和常規取圖之間切換有明顯的時間延遲，所以該方法對快速反應無能為力；第四，刺激激光和取圖激光都使用XY振鏡，并且使用同樣光路，所以刺激速度和效率都受到限制。
OLYMPUS公司新引進的同步雙掃描系統——FV1000-SIM，為光學指示劑及快速解籠鎖、FRAP和FLIP等研究增加了新的手段。該系統除XY掃描振鏡外，另外引入一個同步掃描頭，新的掃描頭與XY振鏡各自獨立工作，只進行光刺激功能。這樣就解決了以往用AOTF或ZOOM方式進行光刺激工作時必須在取圖和刺激間頻繁切換的問題，提高了刺激效率、節省了操作時間。最大的優點是可以在刺激標本的同時，不影響正常的圖像獲取，可以在刺激的同時看到標本的瞬間變化，為FLIP/FREP/Keade蛋白/PA-GFP蛋白/解籠鎖（uncaging）等光刺激研究提供了最佳的解決方案。
鑒于前些年GFP蛋白為蛋白質定位等相關研究帶來的革命性的進展，相信具備更佳性能的光學指示劑會為蛋白定位研究，尤其與蛋白質相關的動態研究帶來更為顯著的推動作用。