土壤的稀釋分離、純化微生物及無菌操作技術

 一、目的和內容

    目的：學習從土壤中分離微生物的方法,學習無菌操作技術.

    內容：

  1．用稀釋法分離細菌、放線菌和霉菌.

  2．用平板劃線方法分離微生物.

  3．學習斜面接種及穿刺接種等無菌操作技術.

二、材料和用具

    金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和普通變形菌(Proteus vulgaris)斜面菌種.

    牛肉膏、高氏1號、土豆蔗糖固體培養基各1瓶,49.5mL無菌水(帶玻璃珠)1瓶,4.5mL無菌水6管,80%乳酸,10%酚液,95%乙醇.

    無菌培養皿12套,1mL無菌移液管10支,土壤樣品及天平、稱量紙、藥勺、試管架、玻璃鉛筆、橡皮頭(用75%乙醇浸泡)、玻璃刮.

三、操作步驟

(一)土壤稀釋分離：

  1、取土壤：取表層以下5—10cm處的土樣,放入無菌的袋中備用,或放在4℃冰箱中暫存.

  2、制備稀釋液(要無菌操作)

    (1)制備土壤懸液：

    稱土樣0.5g,迅速倒入帶玻璃珠的49.5mL無菌水瓶中(玻璃珠用量以充滿瓶底力最好),振蕩5～10min,使土樣充分打散,即成為10-2的土壤懸液.

    (2)稀釋：

    用無菌移液管吸10-2的土壤懸液0.5mL,放入4.5mL無菌水中即為10-3稀釋液,如此重復,可依次制成10-3～10-8的稀釋液(圖 3-1).注意：操作時管尖不能接觸液面,每一個稀釋度換用一支移液管,每次吸入土液后,要將移液管插入液面,吹吸3次,每次吸上的液面要高于前一次,以 減少稀釋中的誤差.

  3、混菌法測定菌落數的方法

    (1)細菌：取10-7、10-6兩管稀釋液各1mL,分別接人相應標號的平皿中,每個稀釋度接兩個平皿.然后取冷卻至50℃的牛肉膏瓊脂培養基,分別倒入以上培養皿中(裝量以鋪滿皿底高1.5～2mm為宜),迅速輕輕搖動平皿,使菌液與培 養基充分混勻,但不沾濕皿的邊緣,待瓊脂凝固即成細菌平板.倒平板時要注意無菌操作.

    (2)放線菌：取10-5、10-4兩管稀釋液,在每管中加入10%酚液5～6滴,搖勻,靜置片刻,然后分別從兩管中吸出1mL加入相應標號的平皿中,選用高氏1號培養基,用與細菌相同的方法倒入平皿中,便可制成放線菌平板.

    (3)霉菌：取10-2、10-3兩管稀釋各1mL,分別接入相應標號的平皿中,每個稀釋度接兩個平皿.在融化的土豆蔗糖培養基中,每100mL加入滅菌的乳酸1mL,輕輕搖勻,然后用與細菌相同的方法倒入平皿中,便可制成霉菌的平板.

4、培養：將接種好的細菌、放線菌、霉菌平板倒置,即皿蓋朝下放置,于28～30℃中恒溫培養,細菌培養1～2d,放線菌培養5～7d,霉菌培養3～5d.觀察生長的菌落,用于進一步純化分離或直接轉接斜面.

(二)平板制作及劃線分離方法：

  1．倒平板：按無菌操作要求,在火焰旁操作,做法如3(1).

  2．劃線分離：使用接種環,從待純化的菌落或待分離的斜面菌種只沾取少量菌樣,在相應培養基平板中劃線分離,劃線的方法多樣,目的是獲得單個菌落,.

(三)斜面接種和穿刺接種：

  1．斜面接種

    (1)取新鮮固體斜面培養基,分別做好標記(寫上菌名、接種日期、接種人等),然后用無菌操作方法,把待接菌種接入以上新鮮培養基斜面上.

    (2)接種的方法是,用接種環沾取少量待接菌種,然后在新鮮斜面上“之”字形劃線,方向是從下部開始,一直劃至上部(圖3—4A).注意劃線要輕,不可把培養基劃破.

    (3)接種后30℃ 恒溫培養,細菌培養48h,放線菌、霉菌培養至孢子成熟方可取出保存.

  2．穿刺接種

    (1)取兩支新鮮半固體牛肉膏蛋白胨柱狀培養基,做好標記(寫上菌名)、接種日期,接種人等).

    (2)接種的方法是,用接種針沾取少量待接菌種,然后從柱狀培養基的中心穿入其底部(但不要穿透),然后沿原刺入路線抽出接種針,注意接種針不要移動.

    (3)接種后30℃恒溫培養, 24h后觀察,比較兩種菌的生長結果.

四、注意事項

  1．一般土壤中,細菌最多,放線菌及霉菌次之,而酵母菌主要見于果園及菜園土壤中,故從土壤中分離細菌時,要取較高的稀釋度,否則菌落連成一片不能計數.

  2．在土壤稀釋分離操作中,每稀釋10倍,最好更換一次移液管,使計數準確.

  3．放線菌的培養時間較長,故制平板的培養基用量可適當增多.

五、實驗結果

    記錄土壤稀釋分離結果,并計算出每克土壤中的細菌、放線菌和霉菌的數量.

    計算方法：選擇長出菌落數30～300之間的培養皿進行計數,按以下公式：

    總菌數/g=同一稀釋度幾次重復的菌落平均數×稀釋倍數