實驗方法原理 質粒克隆操作最費時間的步驟是用電泳的方法對預期大小的外源 DNA 片段和質粒 DNA 片段進行純化，在以下的方案中（取自Struhl 1985)，質粒和外源 DNA 的連接可在低熔點球脂糖存在的條件下完成。
實驗材料 限制性內切核酸酶外源 DNA 片段質粒 DNA
試劑、試劑盒 Tris-ClMgCl2DTTATPT4 噬菌體 DNA 連接酶
儀器、耗材 低熔點瓊脂糖凝膠恒溫板手提式長波紫外燈水浴
實驗步驟
一、材料
1. 酶和緩沖液
(1) 2X T4 噬菌體 DNA 連接酶反應混合物：
1 mol/L Tris-Cl ( pH 7.6 ) 1.0 μl，100 mmol/L MgCl2 2.0 μl，200 mmol/L DTT 1.0 μl，10 mmol/L ATP 1.0 μl，H2O 4.5 μl，T4 噬菌體 DNA 連接酶 1.0 Weiss 單位。
每個連接反應需 10 μl 體系。
每次應用前需新鮮配制，裝于微量離心管中在冰中預冷，將反應混合物置于冰上備用。
(2) 限制性內切核酸酶
2. 凝膠
低熔點瓊脂糖凝膠
3. 核酸和寡核苷酸
外源 DNA 片段，質粒 DNA ( ~100 μg/ml，經去磷酸化處理）
每次連接反應大約需要 100 ng 去磷酸化的 DNA。
4. 專用設備
可設置 70℃ 的恒溫板，手提式長波紫外燈（302nm），可設置 16℃ 的水浴。
二、方法
1. 建立一個酶切反應體系（不超過 20 μl），用適當的限制酶消化一定量的靶 DNA，要求最后能獲得 250 ng 的目的片段。
2. 用低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離 DNA 片段。
3. 長波紫外燈下檢査凝膠中 DNA 的電泳情況，根據條帶的熒光強度估計 DNA 的量，用潔凈的手術刀片切下目的條帶，盡可能少切瓊脂糖（一般約為 40~50 μl）。各目的條帶都留下少許在凝膠中不要切，用于照相中表示各條帶在凝膠電泳中的位置。
4. 將切下的凝膠片分別裝入已做好標記的微量離心管中。
也可以將切下的凝膠片裝在密封的微量離心管中于 4℃ 保存幾天。
5. 離心管置于 70℃ 恒溫塊 15 min 以熔化凝膠條，確定離心管中凝膠的體積并計算含有約 200 ng DNA 所需的體積。
這樣做的目的是用 10 μl 或更小的體積收取 200 ng 量的 DNA。這要取決于實際情況。對于含量低于 10 的條帶（在凝膠中剛好可見)，連接仍可進行，盡管連接效率較低。
6. 預熱一個無菌的微量離心管至 37℃ 立即加入下列成分：
去磷酸化質粒 DNA 60 fmol，外源 DNA 片段 120~240 fmol（不超過 10 μl 體積）。
用一個無菌一次性吸頭快速混勻上述混合物，避免瓊脂糖凝膠凝固。
在連接反應中，外源 DNA 片段與質粒載體的摩爾比一般在 2：1~4：1 之間。
7. 給每一個反應管相應地做兩個對照，一個只加去磷酸化質粒載體，另一個只加外源 DNA 片段。
8. 上述的反應管置于 37℃ 溫育 5~10 min，而后每管加入現冷的 10 μl 2X T4 噬菌體連接酶反應混合物。用一個無菌一次性吸頭快速混勻上述混合物，避免瓊脂糖凝膠凝固。16℃ 溫育 12~16 h。
上述的連接產物可直接用于轉化大腸桿菌或電泳。在做轉化或電穿孔轉化之前，裝連接產物的微量離心管需預先于 70℃ 加熱 10~15 min 以重新熔解已凝固的凝膠。
習慣上，1~5 μl 連接產物可以用來轉化化學方法制備的感受態細胞、而用更為有效的電穿孔轉化法則只需 0.1~1.0 μl 的連接產物。采用更大體積進行電穿孔轉化會增加溶質的濃度，以至使弧光的發生難以預測。