本方案介紹如何用放射性標記探針與固定在濾膜上的轉化菌 DNA 進行雜交，以及從瓊脂板中將與探針特異性雜交的克隆回收培養的方法，這些方法適用于平均長度大于 100 核苷酸的探針。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | 本方案介紹如何用放射性標記探針與固定在濾膜上的轉化菌 DNA 進行雜交，以及從瓊脂板中將與探針特異性雜交的克隆回收培養的方法，這些方法適用于平均長度大于 100 核苷酸的探針。 |
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| 實驗材料 | 帶有固定轉化克隆 DNA 的濾膜寡核苷酸探針 |
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| 試劑、試劑盒 | 甲醛預雜交 雜交液BLOTTO預洗液洗脫液 |
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| 儀器、耗材 | LB、TY 或 Terrific 肉湯 |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶劑
甲醛，預雜交/雜交液，1X BLOTTO，預洗液（6X SSC 或 6X SSPE），洗脫液 1（2X SSC，0.1% (m/V) SDS），洗脫液 2（1X SSC，0.1% (m/V) SDS），洗脫液 3（0.1X SSC，0.1% (m/V) SDS）。
2. 培養基
含有適當抗菌素的 LB、TY 或 Terrific 肉湯。
3. 核酸和寡核苷酸
帶有固定轉化克隆 DNA 的濾膜。
4. 探針
32P 標記的雙鏈 DNA 探針或合成的寡核苷酸探針。
5. 專用設備
(1) 水浴鍋
(2) 玻璃烤盤（15 cm X 7.5 cm X 5 cm ) 或其他雜交容器
(3) 溫度可調至 42℃（如在甲醛中進行預雜交）、50℃ 和 68℃ 的培養箱
(4) 放射性墨水
(5) 水溶膠條
(6) Whatman 3 MM 濾紙或相當產品
(7) 木制牙簽或接種環
二、方法
濾膜的預洗脫和預雜交
1. 將已經過烤干或交聯處理的濾膜漂浮于托盤中 2X SSC 液體表面，直至濾膜從底部完全浸濕，再浸泡 5 min。
由于某些批號的硝酸纖維膜可在雜交和干膜過程中發生膨脹和交形，這會使以自顯彩片上的方向性標記與濾膜或瓊脂板進行校對很困難。使用前將干的濾膜加在濕的 3 MM 濾紙之間進行高溫高壓 [10 psi（0.70 kg/cm2) 10 min ]，可以部分緩解這一問題。尼龍膜不存在此問題。
2. 將濾膜轉移至盛有至少 200 ml 預洗脫液的玻璃烤盤內，將液體中的濾膜疊成一摞，用保鮮膜封好烤盤，置于培養箱內的旋轉平臺上，于 50℃ 保溫 30 min。
預洗脫可去除細菌克隆殘體，尤其是對密度很高的克隆進行篩選時，可明顯降低雜交背景。
在這里以及以后的所有步驟中，濾膜都應緩慢搖動以防止相互粘在一起。在預洗、預雜交或雜交等所有過程中，都不要使濾膜干燥。
3. 用經預洗脫液浸泡過的 Kimwipes 刮去濾膜表面的細菌殘體，將細菌殘體刮除不會影響陽性雜交信號的密度和清晰度。
4. 將濾膜轉移至盛有 150 ml 預雜交液的玻璃烤盤內，于適當溫度下（如雜交在水溶液中完成用 68℃；在 50% 甲醛中完成用 42℃）緩慢晃動 1~2 h 或更長。
濾膜應被預雜交液完全覆蓋。預雜交過程中，硝酸纖維膜上被單鏈或雙鏈 DNA 非特異結合的部位應由 BLOTTO 液中的蛋白質所封閉。搖動可使濾膜連續地被預雜交液所沐浴和覆蓋。
探針的變性與雜交濾膜
5. 于 100℃ 加熱 5 min 使 32P 標記的雙鏈 DNA 探針變性，然后立即置于冰浴中。
也可用加入 0.1 體積的 3 mol/L NaOH 進行探針的變性。于室溫 5 min 后，將探針轉至冰浴中并加入 0.05 體積的 1 mol/L Tris-HCl (pH 7.2) 和 0.1 體積的 3 mol/L HCl。置探針于冰浴中直至使用。
單鏈探針無需變性。
6. 將探針加入到覆蓋濾膜的預雜交液中，于適當溫度溫育直至 C0t1/2 達到 1~3。雜交過程中，應將容器密封以防止液體因蒸發而丟失。
7. 雜交完成后，傾去雜交液，并迅速將濾膜浸泡于大體積（300~500 ml ) 的洗液 1 中，緩慢晃動濾膜并至少翻轉一次。5 min 后，將濾膜轉至盛有新洗液的容器內，繼續緩慢晃動。重復洗膜兩次以上。
8. 于 68℃ 在 0.5~1.5 h 內用 300~500 ml 洗液 2 洗膜兩次。
9. 將濾膜置于 3 MM 濾紙上，室溫干燥。在濾膜下面貼上水溶膠條，再將濾膜置于一張干凈、干燥而平展的 3 MM 濾紙上，緊壓濾膜使之與濾紙粘牢。
10. 用放射性墨水或化學發光試劑在 3 MM 濾紙幾個不對稱位置上作標記。用保鮮膜覆蓋濾膜和已作標記的濾紙，用膠條從濾紙的背面粘牢保鮮膜，平展覆蓋濾膜的保鮮膜去除皺褶。
這些標記可用來對自顯影片與濾膜進行校對。
雜交信號的分析和陽性克隆鑒定
11. 用酸光成像的濾膜或用 X 射線片（Kodak XAR-2，XAR-5，或其他相當產品）在 -70℃ 曝光 12~16 h 和增感屏分析濾膜。
12. 用放射性墨水留下的標記對 X 射線片與濾膜進行校對，用非放射性纖維頭鉛筆以非黑顏色在編號的濾膜上作出與 X 射線片不對稱點位置一致的標記。
13. 在 X 射線片上貼一張透明紙，在透明紙上標記出陽性雜交信號的位置，也標記出 ( 用不同顏色）不對稱點的位置。從 X 射線片上揭下透明紙，通過透明紙上的標記與瓊脂板標記的對應關系，鑒定出陽性克隆。
14. 用無菌牙簽或接種環將陽性克隆轉移至 1~2 ml 含有適當抗菌素營養豐富的培養基 ( LB、YT 或 Terric 肉湯）中。
15. 經過一段時間培養，用微量制備方法之一可從培養物中提取質粒 DNA，并可用限制酶酶切或 PCR 方法進一步分析質粒 DNA。 |
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