1．分別設立兩個反應，用適當的限制性內切核酸酶消化1~10μg質粒DNA和外源DNA片段，使它們能產生平末端。
2．苯酚：氯仿抽提與乙醇沉淀法純化出已被消化的載體和外源DNA片段。
3．分別用TE（pH 8.0）重新溶解純化出的兩種DNA沉淀，使終濃度為100 ng/ml。 假設1 bp相當于660 Da，計算DNA的終濃度（pmol/ml）。
4．將載體DNA去磷酸化。
5．按下表將適量的DNA轉移至無菌的0.5 ml離心管：
| 管號 | DNA |
| A和E | 載體1 [60fmol (~100ng)] |
| B | 外源插入片段2[60fmol (~10ng)] |
| C和F | 載體1（60fmol）和外源插入片段3（60fmol） |
| D | 線狀載體（5’-磷酸化）（60fmol） |
| G | 環狀載體[60fmol (~10ng)] |
1 載體DNA已進行去磷酸化
2 外源目的DNA可以連接接頭。
3 連接反應中，質粒載體和插入的DNA片段摩爾比一般為1：1。DNA的總濃度應約為10ng/μl。
a. A、B和C管中加入：
10×連接緩沖液 1.0μl
T4噬菌體連接酶 0.5 Weiss單位
5 mmol/L ATP 1.0μl
H2O 補至8.5μl
30%PEG 8000 1~1.5μl
b. D、E和F管中加入：
10×連接緩沖液 1.0μl
5 mmol/L ATP 1.0μl
H2O 補至8.5μl
30%PEG 8000 1~1.5μl
不加DNA酶
6．連接反應體系置于16℃水浴溫育過夜或20℃水浴溫育4 h。
7．用每份稀釋的連接產物轉化感受態大腸桿菌。轉化時，應包括用標準方法制備的已知量的超螺旋質粒DNA作為對照，以檢查轉化效率。
| 管號 | DNA | 連接酶（有/無） | 預期轉化克隆數 |
| A | 載體1 | + | ~03 |
| B | 插入片段 | + | 0 |
| C | 載體1和插入片段 | + | 比F管高5倍 |
| D | 載體1 | - | ~0 |
| E | 載體2 | - | 比D管高50倍 |
| F | 載體和插入片段 | - | 比D管高50倍 |
| G | 環狀質粒 | - | 2×105 |
1 去磷酸化
2 未去磷酸化
3 如果出現來自去磷酸化的載體DNA自身連接產物的轉化子，是由于用堿性磷酸酶處理時未能除盡5’端的磷酸基。