培養活細胞的觀察方法

培養活細胞可用相差顯微鏡，也可用縮時攝影直接記錄活細胞的動態變化，還可將離體活細胞染色。

一、相差顯微鏡直接觀察法：
活細胞對光線是透明的，光線通過活細胞時，波長和振幅幾乎沒有改變，所以用普通光鏡無法看清未經染色的活細胞。為了觀察活細胞的結構，則需要通過其他途徑提高結構的反差。20世紀30年代，荷蘭物理學家Zernike設計的相差顯微鏡利用光的衍射和干涉特性，把透過標本不同區域的光波的光程轉變成振幅差，使細胞內各種結構之間呈清晰可見的明暗對比，從而成功地解決了生物學上的難題。
相差顯微鏡由相差聚光器和相差接物鏡兩個主要部分組成。它與普通光鏡相比多了兩個部件，一個是在聚光器上增加一個環形光闌，使透光聚光器的光性形成空心光錐、聚焦到標本上。另一個是在物鏡的后焦面增加一個相板，相板有一個環形區，其大小適好通過環形光闌的直射光，相板各區渡以不同物質，使得通過環形區的光比通過相板其他部位的光超前或滯后1/4波長。相差顯微鏡的基本原理：把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提供了各種結構之間的對比度，使標本的各種結構變得更清晰可見。光性透過標本后，發生折射，偏離了未通過標本的的光性的光路，這兩租光性和軸后，則發生相互干涉現象。透過生物標本發生折射的光性與未透過標本的光性之間產生了光程差。前者被阻滯了1/4波長。如果把光程差再增加了1/4波長，則變為1/2波長，和軸后兩束光線的干涉加強，使標本周圍發生暈圈，提高了可見度。
用相差顯微鏡可觀察活細胞，并可在鏡下連續拍攝記錄體外培養細胞的活動，如細胞分裂、細胞遷移運動等過程。相差顯微鏡觀察活細胞的步驟如下：
1、調整好相差顯微鏡：
首先調好相位板使聚光器相位板號與接物鏡方法倍數相一致。然后抽出接目鏡，再換輔助鏡，移動輔助鏡筒并調整聚光器相位板，使視影中兩個大小一樣的光環相互吻合。再從新換上原接目鏡，即成相差圖像。當更換不同倍數接物鏡時，需按上述過程重新調節。
2、觀察培養瓶（皿）準備：
準白觀察的培養瓶（皿）要平坦，質地均勻，透光性好，在觀察前將培養瓶（皿）面擦凈，勿流任何殘留污跡。
3、調光：
主要調整照明光的照明度和光軸，令視野照明均勻。首先用低倍鏡，并把照明燈虹彩光調至最小，使光落于視野中央；如有偏斜可用聚光器的調整螺絲進行調整。然后打開虹彩光使視野內呈均勻照明強度，并使目的物圖像達到最大限度反差為止。
4、調焦與攝影：
較高級的相差顯微鏡視野中間都有雙線十字，調焦前先轉動目鏡使十字的雙線清晰，然后再用調焦旋鈕調節物鏡，使觀察物體清晰。在照相目鏡上也要采用同樣步驟調焦。攝影目鏡與觀察目鏡焦點不一致時，也要根據需要調焦，一般照相時以攝影目鏡為主，觀察時以觀察目鏡為主。
照相時應做好記錄，把細胞種類、代數、觀察內容、放大倍數、時間等一一記錄下來，以備日后檢查和對比。
5、細胞觀察：
生長在瓶底上的細胞懸液最適宜用倒置顯微鏡相差顯微鏡觀察，而且需附有長焦距聚光器，才能觀察厚度較大的培養瓶（皿）。若用油鏡觀察細胞微細結構，需用支持物培養法，把細胞培養在長形蓋片上，觀察時從瓶中取出制成臨時標本。方法為：取一大型載物片，再取一塊優質濾紙剪成長方窗形，置于載物片上，用吸管向紙框中滴數滴培養基，充滿框內空間和浸濕紙框；把生長有細胞的蓋片含細胞面向上放在紙框中，再輔以大蓋片。觀察時應不斷從標本側面滴加加適量營養液，以防不斷蒸發。此法只限于短時間觀察細胞之用。

二、暗視野顯微鏡觀察活細胞：
暗視野顯微鏡是利用特殊的聚光器，是照明光線斜射不能進入物鏡，所以視野是暗的，只有經過標本散射的光線才能進入物鏡被放大，在黑暗的背景中呈現明亮的像。這種特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，甚至可以觀察到5nm的微小質點。這種觀察方法主要用于觀察物體的輪廓，分辨不清內部的微細結構，只適合觀察活細胞的細胞核、線粒體，液體介質中的細菌和霉菌等。所以這種方法已較少應用。

三、縮時顯微鏡攝影觀察：
這是隨著現代科技發展而出現的一種新的觀察方法。縮時顯微鏡攝影術可直接記錄活細胞的連續動態變化過程，能非常直觀地展現細胞生長過程中的動態變化，如細胞運動、細胞分裂、細胞膜變化、細胞死亡等過程。顯微鏡閉路電視系統或接上觀察細胞變化的定格電視記錄裝置，則更直接地觀察到細胞的變化，但由于這套系統較昂貴，所以應用尚不普通。

四、離體活細胞染色觀察：
1、中性紅染色：
中性紅是常用的活體染色體染料，常用的濃度為1：10000，用生理鹽水（或Hanks液）溶解后進行高壓蒸汽滅菌暗處存放，可直接浸染活細胞顯微鏡下觀察或用于細胞的病毒蝕斑，肉眼計算空斑數目。因其毒性大，染色后細胞不能再培養。
2、結晶紫染色：
使用濃度為0.1%，可用生理鹽水，室溫保存。蓋染料對死、活細胞均著色，故只能測出細胞總數。
3、臺盼藍染色：
用0.5%濃度的臺盼藍，用PBS配制，室溫保存，蓋染料只對死細胞著色，可測定活細胞和計算存活百分率。