實驗概要
掌握培養細胞中RNA的檢測方法。
實驗步驟
1．制膠(1％)：
瓊脂糖 2.5g
10×Mops緩沖液 25.0ml
H2O 192.0ml
2．在微波爐中加熱煮沸使膠完全溶于水并滅菌。
3．取出膠冷卻到60℃，于通風柜中加45ml甲醛，混勻。
4．加20μl溴化乙錠，混勻。
5．令膠液再冷卻10分鐘。
6．將其倒入四面封好的電泳槽中，加樣品梳，約20分鐘形成電泳凝膠。
7．加入1×Mops緩沖液于電泳槽，蓋滿膠表面，但不>1cm。
8．取10～15μg RNA樣品，真空離心干燥，再溶于20μl載樣緩沖液，加熱95℃ 2分鐘，使RNA變性。
9．每孔中20μl RNA點樣，同時加一標準物。
10．一般35V電泳，從下午4：00pm～9：30am。
11．取出膠在紫外燈下觀察，將刻度尺放在膠旁照像。成功的電泳在膠上28S(約5kb)18s(約2kb)處可見明顯的溴化乙錠帶。
12．用500ml 10SSC浸泡洗滌膠2次，每次20分鐘，去除甲醛。
13．其它吸印步驟完全與Southern Blot相同，只是吸印緩沖液為10×SSC。
14．室溫下至少吸印12小時。
15．吸印完成后，取出膠與濾膜，表明加樣起始部位、膜的方向及標號、用Whatman濾紙包好，80℃真空干燥2小時；如為尼龍膜在紫外燈下照射5分鐘。
16．分子雜交：雜交原理與Southern Blot相同，但所用雜交液及雜交、洗滌溫度與之不同。預雜交液制備：
50％甲酰胺
1％ SDS
1M NaCl
10％硫酸葡聚糖
17．將濾膜放入塑料袋，加入10ml預雜交液，去除氣泡后封袋，在42℃水浴中振蕩至少6小時。
18．制備變性魚精DNA≥100μg/ml，變性同位素標記的探針(加入袋中的終濃度≤10ng/ml或1～4×105dpm/ml)。
19．將此液0.5～1ml以針頭注入含預雜交液的塑料袋中，排除氣泡，從針眼處重新封死塑料袋，再用玻棒在袋上趕幾次，使探針與預雜交液充分混勻，42℃振蕩水浴6～42小時。
20．膜的洗滌：
1) 2×SSC 100ml室溫中振蕩5分鐘，共2次。
2) 1％SDS，2×SSC 200ml， 60℃振蕩30分鐘，共2次。
3) 0.1×SSC 100ml室溫振蕩30分鐘，共2次。
21. 膜在室溫中自然干燥后，用塑料紙包好即可進行放射自顯影過程(同DNA檢測)。