基于液滴的納升體積的微細管蛋白結晶系統（MP...（三）

4.2 原位X射線衍射

CrystalCard的設計允許進行原位X射線衍射。這允許檢晶儀在改為冷凍保護之前評估結晶體的生長質量并且進行結晶體結構測定的數據采集(Luft et al., 1999; McPherson, 2000; Ng et al., 2003; Yadav et al., 2005; Lunde et al., 2008)。CrystalCard在室溫下足夠透過X射線直接安裝在測角器上。此外，CrystalCard能夠順著X和y軸從多重結晶體重采集數據，用于組合產生的復雜數據集。CrystalCard可以旋轉75度，不會碰到橫梁。為了證實這種方法，我們在NE-CAT beamline 24ID-C（阿貢國家實驗室的APS）（圖6a）CrystalCard 上包含溶解酵素的結晶體并且在室溫下從CrystalCard上的三個結晶體收集X射線衍射數據。CrystalCard.部分分子替換的電子密度圖見圖6（b）。晶體的數據在表1中列出。

圖6：使用MPCS進行的原位衍射。(a)MPCS CrystalCard安裝在有X射線源的測角計頭上。（b）從 MPCS CrystalCard上的三個結晶體收集的X射線衍射數據得到的部分分子替換的電子密度圖。

5.材料和方法

5.1 準備塑料CrystalCard

塑料CrystalCard通過噴射模塑法(Siloam Biosciences Inc.)制作。液滴在CrystalCard中形成需要低表面能（疏水的）。這樣可以確保氟碳油優先濕潤微細管壁。聚碳酸酯CrystalCard從廠家運來時有高表面能（疏水的）。為使微細管表面用于液滴形成，Cytonix PFC 502AFA溶液用于涂抹微細管內部。Cytonix PFC 502AFA粘附在聚碳酸酯表面，而且保持表面能6–10 dyn cm-1（1 dyn cm-1 = 1×10-3N m-1）。有涂層后，CrystalCard充滿Cytonix PFC 502AFA溶液，然后在冰上培養2小時（CrystalCard入口在高溫下容易破裂）。502AFA溶液從CrystalCard 移除時要通過34.5 kPa 真空干燥1小時。烘干后，CrystalCard在333k處理一小時后備用。

5.2 Macro-micro界面

Macro-micro界面連接注射器和CrystalCard用于MPCS正常運轉。360μm內徑，760μm外徑(ID/OD 360/760)的聚四氟乙烯管用于連接注射器和CrystalCard。聚四氟乙烯管的一端接到注射器針頭上，另一端接入一個760毫米內徑硅片管道連接到塑料CrystalCard。PDMS/聚四氟乙烯CrystalCard緊密結合ID/OD 360/760聚四氟乙烯管。

5.3 準備hybrid方法pre-formed cartridge(Li et al., 2006)

一個5-10cm的ID/OD 360/760聚四氟乙烯管連接50μL的注射器，另一頭是10cm的內/外徑比為200μm/230μm（(ID/OD 200/230) 聚四氟乙烯存儲管。連接處有密封的毛細管蠟（(Hampton Research)。注射器和管充滿FC40（3M）并且注射器安有一個手動的吸液器(Stoelting No. 262M=, Wood Dale, Illinois, USA)。ID/OD 200/230聚四氟乙烯存儲毛細管末端用于第一次沉淀劑浸入而且150nL液體（15 units on the aspirator）被吸收。大約50nL氣泡（5 units on the aspirator）被吸收。
這個過程會重復，直到所有的理想的沉淀劑（多達24）全部被吸收。2μLFC40（大約200 units在吸附器上）吸入管內，注射器置于泵上用于實驗。ID/OD 200/230聚四氟乙烯存儲毛細管包括預先形成的cartridge連接在PDMS/聚四氟乙烯CrystalCard沉淀劑入口，使用刀片剪通道插入毛細管水平位置。ID/OD 200/230聚四氟乙烯存儲毛細管插入到PDMS芯片（進口的地方，在這一點變得錐形）并且使用毛細管蠟密封。

5.4 結構測定

數據集采集于APS（Advanced Photon Source）：beamline 19BM（100K）用于蛋氨酸-R-亞砜還原酶，beamline 24-IDC（室溫）用于溶菌酶。數據在HKL-2000（(Otwinowski & Minor, 1997)上進行整合。溶菌酶的結構,強度分別使用MOSFLM package采集三個數據集(Leslie, 1992)。溶菌酶和蛋氨酸-R-亞砜還原酶的結構分別使用MOLREP(Vagin & Teplyakov, 1997)PDB entries 1iee和3cez研究模型進行分子替換。結構精煉使用REFMAC5(Murshudov et al., 1997)，模型構建使用Coot(Emsley & Cowtan, 2004)。

5.5 CrystalCard X射線吸收

使用一個簡單的測試分析CrystalCard X射線吸收。為了做到這一點，離子束的射束電流規范化到APS環形電流（I/I0）。測定用或不用CrystalCard，波長為0.979261 A ?時插入(12.66099 keV)。不用CrystalCard的I/I0為1.91671×10-6，用CrystalCard的I/I0為1.5511×10-6。這樣x射線的19%被CrystalCard吸收。

參考文獻：

[1]Chen, D. L., Gerdts, C. J. & Ismagilov, R. F. (2005). J. Am. Chem. Soc. 127, 9672–9673.
[2]Emsley, P. & Cowtan, K. (2004). Acta Cryst. D60, 2126–2132.
[3]Gerdts, C. J., Tereshko, V., Yadav, M. K., Demetieva, I., Collart, F., Joahchimiak, A., Stevens, R. C., Kuhn, P., Kossiakoff, A. & Ismagilov, R. F. (2006). Angew. Chem. Int. Ed. 45, 8156–8160.
[4]Leslie, A. G. W. (1992). Jnt CCP4/ESF–EACBM Newsl. Protein Crystallogr. 26.
[5]Li, L., Mustafi, D., Fu, Q., Tereshko, V., Chen, D. L., Tice, J. D. & Ismagilov, R. F. (2006). Proc. Natl Acad. Sci. USA, 103, 19243–19248.
[6]Luft, J., Rak, D. M. & DeTitta, G. T. (1999). J. Cryst. Growth, 196, 450–455. Lunde, C. S., Rouhani, S., Remis, J. P. & Glaeser, R. M. (2008). J. Appl. Cryst. 41, 483–486.
[7]McPherson, A. (2000). J. Appl. Cryst. 33, 397–400.
[8]Ng, J., Gavira, J. A. & Garc?′a-Ruiz, J. M. (2003). J. Struct. Biol. 142, 218–223.
[9]Otwinowski, Z. & Minor, W. (1997). Methods Enzymol. 276, 307–326.
[10]Song, H., Tice, J. D. & Ismagilov, R. F. (2003). Angew. Chem. Int. Ed. 42, 768–772.
[11]Stura, E. A., Satterthwait, A. C., Calvo, J. C., Kaslow, D. C. & Wilson, I. A. (1994). Acta Cryst. D50, 448–455.
[12]Tice, J. D., Lyon, A. D. & Ismagilov, R. F. (2004). Anal. Chim. Acta, 507, 73–77.
[13]Tice, J. D., Song, H., Lyon, A. D. & Ismagilov, R. F. (2003). Langmuir, 19, 9127–9133.
[14]Murshudov, G. N., Vagin, A. A. & Dodson, E. J. (1997). Acta Cryst. D53, 240–255.
[15]Vagin, A. & Teplyakov, A. (1997). J. Appl. Cryst. 30, 1022–1025.
[16]Yadav, M. K., Gerdts, C. J., Sanishvili, R., Smith, W. W., Roach, L. S., Ismagilov, R. F., Kuhn, P. & Stevens, R. C. (2005). J. Appl. Cryst. 38, 900–905.
[17]Zheng, B., Gerdts, C. J. & Ismagilov, R. F. (2005). Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 548–555.
[18]Zheng, B. & Ismagilov, R. F. (2005). J. Am. Chem. Soc. 17, 2520– 2523.
[19]Zheng, B., Roach, L. S. & Ismagilov, R. F. (2003). J. Am. Chem. Soc. 37, 11170–11171.
[20]Zheng, B., Tice, J. D. & Ismagilov, R. F. (2004). Adv. Mater. 16, 1365–1368.
[21]Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S. & Ismagilov, R. F. (2004). Angew.Chem. Int. Ed. 43, 2508–2511.