A: 1 μg HeLa結果比較; B: 50 ng HeLa結果比較. 以每項最高值為100%
3 討論
隨著“一小時酵母蛋白質組”全覆蓋的實現, 蛋白質組深度覆蓋研究迎來新的時代[6]. 在復雜樣本蛋白質組研究中, 傳統方法需要進行二維分離、分級的方式簡化樣本、充分分離, 這樣不僅操作費力, 也需消耗大量的時間. 而Q-OT-qIT質譜技術使得在60 min左右一維短梯度下實現復雜樣本的深度鑒定成為現實.
Q-OT-qIT的三合一結構實現了傳統質譜難以實現的并列運行, 即一級、二級掃描同時進行, 離子注入、選擇、碎裂、檢測同時進行(圖7). 動態掃描管理技術自動控制和實時優化儀器運行, 使3種質量分析器相互配合、同時工作, 盡可能減少掃描過程和循環間隙的等待時間. “減一邏輯”將二級掃描與上一次一級掃描相關聯, 無需等待本次一級掃描確定母離子及電荷, 提高儀器運行速度和分析效率. 以top 10的數據依賴掃描(DDA)為例, 240k分辨率下, 當一級全掃描完成時, 所有二級掃描也同時完成, 一級、二級互不相關、獨立運行(圖7). 此外, top-speed模式在固定時間內盡可能多地激發二級掃描, 相比傳統Top-N模式能更多地采集低豐度肽段, 也保證了一級掃描點數, 有利于同時定性定量.
實驗結果表明, 1 μgHeLa樣本在50 min有效梯度內采集到53209張譜圖, 掃描速度為17.7 Hz, 其中包括120k分辨率的一級軌道阱掃描, 并列運行的工作模式提高了儀器整體運行速度. 在嚴格卡值(1% FDR)下, 鑒定到20860條非冗余肽和3865個非冗余蛋白, 而最新的文獻報道需要至少2~3h才能達到相同結果[9]. 酵母樣本雖未達到Hebert等人[6]報道的蛋白鑒定數量, 但上樣量更低, 并且未進行重復, 比目前其他儀器的報道結果也有2倍以上的提高[8,9]. 在掃描速度方面, Q-OT-qIT雖然未達到Q-TOF類質譜的極限速度, 但譜圖質量更高, 譜圖解析率比Q-TOF類質譜高2~3倍[8].
1 μgHeLa樣本在多次實驗中的譜圖解析率基本達到60%以上, 在加大離子注入時間和注入數量的情況下甚至達到83.1%(表3), 顯示了良好的譜圖質量. 全蛋白樣本體系復雜, 短梯度下會有共流出肽段和基質雜質的干擾, 大量低豐度肽段的二級響應也很弱, 在這樣的情況下, 譜圖解析率達到80%以上, 顯著高于目前的文獻報道[8,9]. 此外, 樣本量決定了蛋白鑒定數量, 傳統蛋白質組學分析需要微克級的全蛋白, 而本實驗嘗試將樣本量降低到納克級, 即50 ng上樣量, 鑒定結果已達到目前微克級的水平, 為低濃度樣本和極低豐度蛋白分析提供可能.
Q-OT-qIT的三合一結構使掃描方式靈活多樣. C-trap與離子阱之間的多極離子通道使離子可以正反向自由移動, 實現了CID/HCD/ETD3種碎裂模式在MSn任意一級使用, 并任意使用軌道阱或離子阱檢測, 產生多種組合的掃描模式. 其中, CID碎裂相比HCD靈敏度略高, 但是速度略慢, 且有三分之一效應, 即低質量端歧視, 而HCD在低分子量段具有豐富的碎片信息; 軌道阱的超高分辨率與質量精度可以最大程度地排除干擾, 而離子阱速度更快, 并且可以和軌道阱同時運行, 提高效率. 可見, 由于機理的不同, 各種掃描模式的效果不同, 具有一定的互補性. Q-OT-qIT控制離子注入時間和注入數量的能力也是保證分析效率和靈敏度的重要因素. 注入時間越長、注入數量越多, 則靈敏度越高、譜圖質量越高, 但掃描速度越慢; 相反, 離子注入數量越少, 速度越快, 但低豐度離子損失越大, 靈敏度下降. 可見, 實驗目的和樣本不同,適合的掃描模式和參數也不同, 因此, 實驗進一步考察了掃描模式和離子注入參數對結果的影響.
結果表明, 不同碎裂模式和檢測方法均具有良好的互補性. 軌道阱和離子阱之間有1/2的鑒定結果不重復, HCD和CID之間有2/3結果不重復, 不同的掃描方法結合可以達到更大的覆蓋范圍. 另一方面, 線性離子阱相比傳統離子阱質量精度更高, 質量偏差穩定保持在0.2 Da以內, 達到中高分辨質譜水平, 因此, OT和IT掃描均具有較高的譜圖解析率. 在離子控制方面, 通過提高最大注入時間和最大注入數量, 可以增加離子注入量, 提高低濃度樣本和極低豐度蛋白的靈敏度; 而降低離子注入量, 能夠加快常規樣本的分析速度、增加鑒定數量. 通過幾種模式和參數的考察、優化, 為蛋白質組快速分析和深度覆蓋研究提供了更多選擇.
4 結論
本文利用Q-OT-qIT三合一質譜, 對HeLa和酵母全蛋白進行了短梯度快速鑒定: (ⅰ) 50 min有效梯度, 從1 μgHeLa中鑒定到20860條非冗余肽和3865個非冗余蛋白, 時間相比目前的報道縮短了50%~60%; (ⅱ) 50 ng極低樣本量, 鑒定到14100條非冗余肽和2877個非冗余蛋白, 譜圖解析率超過50%; (ⅲ) 考察了HCD/CID碎裂模式和IT/OT檢測方法的異同, 結果顯示, 不同方法間互補性良好, 并且均有較高的譜圖解析率; (ⅳ) 考察了離子最大注入時間和自動增益控制對結果的影響, 表明提高注入時間和注入數量可以顯著提高低濃度樣本的檢測靈敏度. 綜上所述, 基于Q-OT-qIT質譜, 本文實現了短時間內對復雜樣本蛋白質組深度覆蓋分析, “一小時蛋白質組”時代已經到來.
圖7 Q-OT-qIT質譜結構與并列運行原理
軌道阱一級全掃描的同時, 四極桿依次進行若干母離子選擇, 離子阱依次進行若干母離子的二級碎片掃描, 三者同時運行
致謝 部分圖片素材由賽默飛世爾科技圣何塞工廠提供.
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The One Hour Proteome: Q-OT-qIT Mass Spectrometry Based Rapid Proteome Identification
ZHANG Wei, GU PeiMing, JIANG Zheng, MING Hong & CHEN Wei
ThermoFisher Scientific China, Shanghai 201206, China
With the realization of “the one hour yeast proteome”, in-deep proteome under rapid LC-MS/MS gradient is achieved. The current study utilized novel Q-OT-qIT mass spectrometer to analyze and optimize “the one hour proteome”. Within 50 min LC-MS/MS gradient, a total of 20860 and 14100 unique peptides were identified from 1 μg and 50 ng HeLa digest, corresponding to 3865 and 2877 proteins, respectively. Similar result from current reports used at least 2–3 h gradient. The effect of various collision modes, detectors, maximum injection times and automatic gain control settings were further evaluated, and the complementarity between different acquisition methods and scan parameters were described. Moreover, the massive parallelization of Q-OT-qIT was discussed, providing useful information for rapid proteome analysis.
proteomics, rapid identification, deep coverage, orbitrap, Q-OT-qIT MS
doi: 10.1360/10.1360/052014-16