基因修飾和動物模型

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　　生物通報道：轉基因技術的出現成功實現了將目的基因插入到實驗動物的基因序列中, 這為研究疾病的分子機理提供了極其有用的工具。近期來自中科院上海高等研究院，干細胞和納米醫學研究中心等處的研究人員針對當前構建靶向轉基因動物模型的各種技術進行了解析和評估。

　　轉基因小鼠模型是通過顯微注射的方法將DNA(目的基因)注射入原核內, 這種典型的技術在遺傳學界已經廣泛應用了30 年. 然而, 這種傳統的轉基因技術缺乏精確定位: DNA片段被隨機地、多拷貝地插入, 形成連環體; 插入的DNA片段易發生突變; 或因為插入位點的限制, 發生位置效應, 使得目的基因的表達不穩定, 甚至不表達。以上種種現象導致了在應用隨機轉基因技術的時候, 需要獲得多個原代鼠, 以篩選符合實驗設計的轉基因表型。

　　目前, 通過在目的基因兩側插入絕緣子序列可以保護轉入的基因不受周圍調控因子影響, 這種方法可以部分解決隨機轉基因技術帶來的位置效應問題. 同時, 細菌載體大片段DNA (<300 kb)也可以減少位置效應的發生. 然而, 動物攜帶多拷貝的大片段基因可能造成不可預計的表型. 根據現有的研究結果, 目前最有效的解決位置效應的方法是將目的基因插入到特定基因位點, 即靶向轉基因, 如目前快速定點的轉基因技術TARGATTTM。

　　在這篇文章中，研究人員就靶向轉基因技術和基因修飾領域中的新興技術進行了評述。其中也詳細介紹了利用ZFNs和TALEN實現位點特異的轉基因插入。

　　ZFNs和TALEN是一類重組DNA結合蛋白, 通過在用戶指定的位點形成DNA雙鏈斷裂, 促進高度特異性的有針對性的基因組編輯. Brinster等人在多年前發現, 原核注射過程中可能發生同源重組, 但頻率非常低. 利用ZFNs和TALENs技術對限制性核酸內切酶進行設計, 使之靶向基因組中的特定位點. 隨后核酸內切酶造成靶位點的雙鏈斷裂, 該損傷可以通過非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)進行修復而產生裂解位點的突變, 或由同源重組方式修復.

　　雖然ZFNs和TALENs的核酸酶部分也有類似的性質, 這2種重組的核酸酶之間的區別是在其DNA識別肽部分. ZFNs結合3個堿基對, 而TALENs與單個核苷酸結合, 使它們可以靶向基因組上的任何地方. 此外, 與ZFNs相比,TALENs基因編輯便于用戶使用, 甚至連非該領域的研究人員也可操作, 而且生產成本低. TALENs定位遵從相對簡單的設計參數, 不依賴于上下游的序列, 通常可以比ZFNs靶向更多的基因組位點。

　　通過直接向胚胎注入基因靶向分子復合物并產生后代, 人們利用ZFNs和TALENs成功地構建了“基因敲除”的小鼠和大鼠模型, 而不需使用相應類型的干細胞. ZFNs 和TALENs直接注射入大鼠和小鼠胚胎的原核后, 主要通過NHEJ途徑, 產生的后代中20%~70%的幼崽攜帶一個或多個突變. 這提供了一個高效率的建立“基因敲除”的方式. 然而, 對于“敲入”模型需要進行同源重組(homologues recombination, HR), 而其在切割位點的效率是很低的. 據 報道, ZFN 或TALEN輔助同源插入轉基因占出生小鼠的1%~5%.

　　通常情況下, 這些動物是嵌合體, 還攜帶NHEJ引起的突變, 需要進一步鑒別飼養. 同時, 也存在未被發現的ZFN或TALEN脫靶影響的可能性. 目前ZFN或TALEN介導的同源重組的效率仍然遠低于其基因組報道的由PhiC31介導的特定位點的整合插入. 此外, 目前ZFNs的成本使大多數實驗室望而卻步. 如果能夠增加效率, 比如通過阻斷NHEJ促進同源重組, 降低成本, ZFN 和TALEN的介導的基因修飾將成為靶向轉基因的主要手段。

　　此外研究人員還介紹了基因修飾領域的新興技術，如Cre和Flp主要應用于靶向等位基因的條件性操作; PhiC31, ZFNs, TALEN等應用于精確和高效地進行胚胎基因組微調.

　　在2013年2月15日的Science上, 哈佛Church博士研究組聯合麻省理工-哈佛Broad研究所的Zhang博士研究組在同一期分別報道了使用CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats, 集群定期空隙短回文重復)/CRISPR相關系統(CRISPR-associated, CAS)在小鼠和人類細胞進行定點的基因組編輯.

　　之后, 在2013年5月9日的Cell雜志中, 麻省理工學院Broad研究所的Jaenisch研究組發表了另一篇關于CRISPR/CAS介導的基因工程技術論文, 闡述了一步到位地構建多靶點基因突變的小鼠模型。

　　作者指出，CRISPR/CAS 系統可以快速地構建多靶點基因修飾的動物模型, 從而大大加速該基因家族的活體功能研究和各基因間相互影響的研究.然而, 在應用該系統的過程中, 構建條件性等位基因、或精確地插入大片段的DNA(如報告基因GFP)、或進行條件性敲除及構建特殊基因的報告小鼠的成功率還不清楚. 目前, 條件性敲除小鼠只能在干細胞中通過同源重組的方式才能實現. 另一方面, 將大片段的DNA精確地插入特定位點可通過整合酶TARGATT的方法實現。