基因工程的載體1

引 言

基因克隆的本質是使目的基因在特定的條件下得到擴增和表達，而目的基因本身無法進行復制和表達、不易進入受體細胞、不能穩定維持，所以就必須借助于“載體”及其“寄主細胞”來實現。

作為基因克隆的載體必須具備以下特性：

⑴載體必須是復制子。

⑵具有合適的篩選標記，便于重組子的篩選。

⑶具備多克隆位點（MCS），便于外源基因插入。

⑷自身分子量較小，拷貝數高。

⑸在宿主細胞內穩定性高。

一、質粒載體

（一）質粒的生物學特性

（1）質粒是獨立于染色體以外的能自主復制的裸露的雙鏈環狀(少數為線形和RNA） DNA分子。

廣泛從在于細菌細胞中，比病毒更簡單。在霉菌、藍藻、酵母和一些動植物細胞中也發現了質粒，目前對細菌的質粒研究得比較深入，特別是大腸桿菌的質粒。大腸桿菌的質粒主要有F質粒（F因子）、R質粒（抗藥性因子）和Col質粒（大腸桿菌素因子）三種。

（2）質粒的大小差異很大，最小的只有1kb,只能編碼中等大小的2-3種蛋白質分子，最大的達到200kb。

（3）質粒的生存在寄主細胞中“友好”地“借居”，離開了寄主它本身無法復制；同時質粒往往有宿主專一性，如大腸桿菌的復制起點不一定能在其它生物細胞中繁殖。

（4）質粒的復制類型一種質粒在宿主細胞中存在的數目稱為該質粒的拷貝數。據拷貝數將質粒分為兩種復制型：“嚴緊型”質粒（stigent plasmid）,拷貝數為1-3；“松弛型”質粒（relaxed plasmid）,拷貝數為10-60。不過即使是同一質粒，其拷貝數在不同的寄主細胞間和不同的生長環境也可能有很大的變化。

（5）質粒的不親和性 兩種親緣關系密切的不同質粒不能在同一宿主細胞中穩定共存。載體質粒與受體的質粒應是不同的不親和群。

⑹ 質粒的轉移

轉移性質粒，含有tra基因；能通過結合作用從一個細胞轉移到另一個細胞。

非轉移性質粒，不含tra基因；可以為轉移性質粒所帶動轉移。

（7）質粒的存在形式有超螺旋、開環雙螺旋和線狀雙螺旋三種，

（二）質粒DNA的制備

有多種分離質粒的方法，如堿裂解法、煮沸裂解法、層析柱過濾法等。

目前一般使用堿變性法制備質粒DNA。這個方法主要包括培養收集細菌菌體，裂解細胞，將質粒DNA與染色體DNA分開及除去蛋白質和RNA。

1.堿變性法質粒提取的原理：

根據共價閉合環狀質粒DNA與線性染色體DNA片斷之間，在拓撲學上的差異而發展出來的。
在pH值12.0～12.5范圍內時，線性的DNA會被變性而共價閉合環狀質粒DNA卻不會被變性。

通過冷卻或恢復中性pH值使之復性，線性染色體形成網狀結構，而cccDNA可以準確迅速復性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質粒DNA。

2.堿變性法提取質粒的步驟：

（1）取1.5毫升含質粒的大腸桿菌過夜培養物，加在微量離心管中，離心收集細胞沉淀；

（2）加入100微升冰冷的溶液I，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA）渦旋震蕩懸浮菌液。

（3）加入200微升新配制的溶液II，（0.2M NaOH，1.0%SDS）緩緩混勻置室溫5分鐘。

（4）加入150毫升冰冷的溶液III，（醋酸鉀29.4克，冰乙酸11.5毫升，加蒸餾水至100毫升）顛倒離心管10次后，冰浴5分鐘。

（5）離心的上清液用苯酚抽提數次，用乙醇沉淀收集質粒DNA。

（三）質粒載體的改造

⑴去掉不必要的DNA區段。

⑵減少限制酶的識別位點，一種酶只保留一個。（單一的限制性酶切位點）。

⑶加入易于撿出的選擇性標記基因。

⑷對質粒進行安全性改造，要求質粒不能隨便轉移。

⑸改造或增加基因表達的調控序列。

1、質粒pBR322

結構：

（1）氨芐青霉素抗性基因（ampr或Apr）

內部有3種限制酶單一識別位點 。

（2）四環素抗性基因（tetr或Tcr）

內部有7種，啟動區內有2種限制酶單一識別位點 。

（3）DNA復制起點（ori）

pBR322質粒的優點：

（1）具有較小的分子量。

4363bp，2.6×106Da，

（2）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號。

（3）具較高的拷貝數，而且經過氯霉素擴增之后,每個細胞中可累積1000～3000個拷貝。

（4）對多種常見的限制性內切核酸酶只含有一個能切割的位點。