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  • 發布時間:2020-12-02 16:59 原文鏈接: 基因擴增PCR的擴增與克隆方法及使用的一些小建議

      基因擴增PCR主要有冰箱、超凈臺、加樣器、混勻器、天平等。加樣器、天平除了要專用外,還應有定期校準。試劑分裝應在超凈臺中進行,擴增反應混合液應使用分子生物學級的,試劑制備好后應有質檢:一是否有污染、二是檢測試劑的擴增效果。

     

      基因擴增PCR的擴增與克隆方法:

      ①引物的序列應位于基因組DNA的高度保守區,且與非擴增區無同源序列。這樣可以減少引物與基因組的非特異性結合,提高反應的特異性

     

      ②引物長度:15-40bp為宜。引物過短或過長均可使反應的特異性下降。

     

      ③引物的堿基盡可能隨機發布,避免出現數個嘌呤或嘧啶的連續排列,G+C堿基的含量在40%-75%之間。

     

      ④引物內部應避免形成二級結構,特別是引物的末端應避免有回文結構。

     

      ⑤二個引物不應有互補序列,特別是3’端應避免互補,以免形成“引物二聚體”,浪費引物。

     

      ⑥引物5’末端堿基無嚴格限制,在與模板DNA結合的引物長度足夠的條件下,其5’端堿基可不與模板DNA互補而呈游離狀態,因此可在引物5’端加上限制性內切酶位點、啟動子序列或其它序列等以便于PCR產物的分析克隆等,引物的5’端至多可加10個堿基而對PCR反應無影響。

      基因擴增PCR的使用建議:

      1、使用本制品時務必將Buffer反復混勻后再加,避免因組分不一導致結果差異;

     

      2、配置和分裝反應液時請一定使用新的(無污染的)噴頭以避免污染;

     

      3、如擴增條帶多,可適當添加酶和dNTPs;

     

      4、當多重PCR擴增產物的長度均在1kb以內時,使用3%~4%濃度的Agarosegel進行電泳分離效果。


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