基因測序原理

基因是位于DNA上的,其測序的原理是一樣的
DNA測序的方法有很多種.
目前最常見的是雙脫氧終止法了.
在測序用的緩沖液中含有四種dNTP及聚合酶.
測序時分成四個反應,
每個反應除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的A,
C,
G,
T核苷三磷酸(稱為ddATP,
ddCTP,
ddGTP,
ddTTP),
然后進行聚合反應.
在第一個反應物中,
ddATP會隨機地代替dATP參加反應一旦ddATP加入了新合成的DNA鏈,
由于其3位的羥基變成了氫,
所以不能繼續延伸.
所以第一個反應中所產生的DNA鏈都是到A就終止了;
同理第二個反應產生的都是以C結尾的;
第三個反應的都以G結尾,
第四個反應的都以T結尾,
電泳后就可以讀出序列了.
也許這樣說你不一定明白.
舉一個例子,
假如有一個DNA,
互補序列是GATCCGAT,
我們試著做一下:
在第一個反應中由于含有dNTP+ddATP,
所以遇到G,
T,
C三個堿基時沒什么問題,
但遇到A時,
摻入的可能是dATP或ddATP,
比如已合成到G,
下一個如果參與反應的是ddATP則終止,
產生一個僅有2個核苷酸的序列:
GA,
否則繼續延伸,
可以產生序列GATCCG,
又到了下一個A了.
同樣有兩種情況,
如果是ddATP摻入,
則產生的序列是GATCCGA,
延伸終止,
否則可以繼續延伸,
產生GATCCGAT.
所以在第一個反應系統中產生的都是以A結尾的片段:
GA,
GATCCGA,
同理在第二個反應中產生的都是以C結尾的片段:
GATC,
GATCC,
在第三個反應中產生的都是以G結尾的片段:
G,
GATCCG
在第四個反應中產生的都是以T結尾的片段:
GAT,
GATCCGAT,
電泳時按分子量大小排列,
A反應的片段長度為2,
7;
C反應的為4,
5;
G反應的為1,
6;
T反應的為3,
8,
四個反應的產物分別電泳,
結果為
8
7
6
5
4
3
2
1
A
|
|
C
|
|
G
|
|
T
|
|
我們可以從右向左讀,
為GATCCGAT,
至此,
測序完成