劉芝華 中國醫學科學院腫瘤研究所 分子腫瘤學國家重點實驗室
概念：
基因組文庫是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體；cDNA文庫是指含有所有重組cDNA的克隆群體。
基因組文庫：來源于基因組DNA，反映基因組的全部信息，用于基因組物理圖譜的構建，基因組序列分析，基因在染色體上的定位，基因組中基因的結構和組織形式等。
cDNA文庫：來源于細胞表達出的RNA，反映基因組表達的基因序列信息，用于研究特定細胞中基因的表達狀態和表達基因的功能等。
基因文庫＝基因組文庫＋cDNA文庫
載體的種類和特征：
受體細胞 | 結構 | 插入片段 | 舉例 | |
質粒 | E.coli | 環狀 | 很小，<8kb | pUC18/19 ,T-載體, |
λ噬菌體 | E.coli | 線狀 | 9-24kb | EMBL，λgt系列 |
絲狀噬菌體及噬菌粒 | E.coli | 環狀 | <10kb | M13系列 |
粘粒載體 | E.coli | 環狀 | 35-45kb | |
BAC | E.coli | 環狀 | 約300kb | |
PAC | E.coli | 環狀 | 100-800kb | PCYPAC |
YAC | 酵母細胞 | 線性染色體 | 100-2000kb | |
MAC | 哺乳動物細胞 | 環狀 | >1000kb | |
病毒載體 | 動物細胞 | 環狀 | SV40 載體，昆蟲桿狀病毒載體 | |
穿梭載體 | 動物細胞和細菌 | 環狀 | pSVK3質粒，PBV,Ti質粒， |
基因組文庫構建步驟：
· DNA的制備：高分子量的外源DNA 100-150kb
· 剪切：隨機切割
· 載體：
l噬菌體：48.5kb,插入型(最多可容納9kb)、取代型(可容納 38-51kb，最適19-20kb)， EMBL, Charon 粘性質粒(Cosmid)：4-6kb, 質粒+噬菌體的性質，可容納大片段的外源基因，最多可容納46kb。
酵母人工染色體克隆體系（YAC，Yeast Artificial Chromosome Cloning System）
插入大小200—1000kb
· 載體DNA的制備：
載體DNA酶切反應-----載體臂的純化-----載體脫磷處理 （常用BamHI） （蔗糖密度梯度離心） （堿性磷酸酶）
· 連接和包裝：外源片段與兩臂之間的比例，包裝蛋白
· 感染宿主菌：選擇合適的宿主菌，LE392, NM538, NM539, KW251等
· 基因組文庫的保存和擴增：完整性和代表性
測滴度，要在106fu以上; 保存，氯仿4℃，7% DMSO -70℃
人類染色體3X109，平均插入片段大小17 kb
cDNA文庫的構建
· 分類： 按表達類型分：表達型、非表達型
按載體類型分：質粒cDNA文庫、噬菌體cDNA文庫
· cDNA文庫的構建步驟：
· 關鍵：mRNA的獲得。完整、種類多、不能降解。電泳應在0.5-8kb之間。已知探針做Northern或PCR。
· 反轉錄：AMV鳥成髓細胞性白血病病毒
M-MLV 鼠白血病病毒
引物：oligo dT, Random primer
摻入同位素檢測
· cDNA第二鏈的合成
· 載體： lgt10, lgt11, lZAP等。
克隆入l噬菌體的效率是克隆入質粒中的30倍。
l ZAP II：(i) l噬菌體高效；(ii) 質粒易操作；(iii) 藍白斑；(iv) 插入大小10kb；(v) 可表達融合蛋白，可用DNA探針或抗體來篩選；(vi) 體內自我剪切
· 從少量RNA中建cDNA文庫：
一般情況下，只有10%的mRNA可變成可克隆的雙鏈cDNA，而且體外包裝和細菌轉化都會再次降低效率，很多人結合PCR，但有非特異性。
---結合Solid-phase RNA Capture System, 可用5ng mRNA，這時oligo dT結合在一個磁珠上，做第二鏈的模板；
---用Universal Buffer，從cDNA第一、第二鏈的合成，到連Linker等全在一個系統內進行。
· cDNA文庫的標準化：使高豐度的信息相對減少、低豐度的信息相對增多的過程。
減少反復重復，但也會丟失一些信息。
----與基因組DNA雜交；---應用二級動力學原理在溶液中使雙鏈DNA再退火。
理論上，在單細胞中，去除高豐度者可使低豐度者聚集3倍或更少。因為細胞中1/3mRNA在細胞中有1-10拷貝。
· 定向克隆的cDNA文庫：大量EST測序時會用到。
· 好的cDNA文庫的標準：
---具有代表性，含所有帶PolyA尾的RNA群體且各類型出現頻率也與之一致；
---大部分含有較長或全長的cDNA插入序列；
---少有基因組、線粒體DNA、核糖體RNA的污染。
· cDNA文庫的篩選：
DNA探針，抗體，標記蛋白
文庫的擴增：
噬菌體文庫加SM，粘粒和質粒文庫LB。
文庫的保存：
噬菌體文庫：4℃（加氯仿）可保存幾年，-70℃（7% DMSO）
長期保存；粘粒和質粒文庫：15%甘油，-70℃凍存。
文庫的篩選：
·選擇文庫
·所要篩選的克隆數：
--對基因組文庫取決于克隆片段的大小和基因組的大小
N=Ln(1-P)/Ln[1-(I/G)]
其中I：克隆片段的隨機大小，G：靶基因組的大小，P：分離到基因的概率。
--對cDNA文庫取決于所要片段的表達豐度和基因組的大小
用核酸做探針還是用抗體做探針