前言：近年來，CRISPR基因編輯技術正在席卷整個生物醫學研究領域，上一期我們已先從CRISPR系統開發及機制研究方面梳理了2018年相關大事件。伴隨著基礎技術不斷優化，CRISPR技術的應用也更加廣泛，如動物造模、藥物篩選、單堿基編輯技術、細胞譜系示蹤、基礎疾病研究、疾病診斷、體內編輯和遺傳病校正等方面。值得一提的是，全球首例基于CRISPR的基因編輯臨床試驗已于2018年開始實施[1]，同年12月，FDA又批準Editas的一項利用CRISPR技術治療先天性黑朦病的臨床試驗申請，有望成為世界上第一種在人體內使用CRISPR技術的療法。本期小編就先從動物造模及單堿基技術等方面帶大家瀏覽一下近一年里CRISPR技術應用的重大突破。
CRISPR技術的五大應用領域
一、大動物造模
CRISPR-Cas9系統以其簡易的操作為動物模型的構建提供了高效的方法。目前基于CRISPR-Cas9構建的各種人類疾病的動物模型數以千計，主要以嚙齒類動物（如小鼠）模型為主，其相關的發病機制和治療進展為臨床應用提供了許多有價值的參考。邦耀實驗室也一直致力于相關研究，在國際知名期刊上發表多篇關于基因編輯大小鼠構建及其在多種疾病上應用的文章，并為廣大的科研用戶提供了數百種基因編輯動物模型。
盡管小鼠模型可以很好地展示疾病的表征，但由于壽命和生理構造等方面的巨大差異，對于許多神經退行性疾病以及同年齡相關等的疾病，并不能很好地模擬許多人類疾病的相應表征。因此，在遺傳學、解剖學和生理學上與人類更接近的大型哺乳動物模型的構建顯得尤為重要。由于胚胎干細胞技術較難、繁殖周期太長和基因編輯效率低等障礙，大型哺乳動物模型的構建一直都是科技攻關的難點。
然而，隨著CRISPR-Cas9技術的快速發展，現有的基因編輯工具已被證明能夠成功構建各類大型哺乳動物模型。2018年中國科學家在基因編輯豬和猴上做出了重要貢獻，在基于CRISPR-Cas9技術構建基因編輯大型哺乳動物模型方面引領了世界的腳步。
“基因敲入”豬：亨廷頓舞蹈病豬模型的構建
2018年3月，來自中國的多個團隊合作建立了一個“基因敲入”的亨廷頓舞蹈癥（HD）豬模型，利用CRISPR-Cas9技術將導致HD的mHTT基因片段整合入豬成纖維細胞中，再通過體細胞核移植技術獲得mHTT轉基因豬模型，這一研究為測試HD療法提供了一種重要的動物模型[2]。
2. 六篇文章奠定了我國科學家在構建基因編輯猴模型中的世界領先地位
l 2018年年初，中科院神經科學研究所的研究人員首次報道了，通過在胚胎細胞分化為特殊細胞時去除DNA上的化學修飾的方式，成功克服了非人靈長類動物的體細胞克隆的限制，首次實現了基因克隆猴的誕生（見圖1a），標志著非靈長類動物體細胞克隆技術的里程碑[3]。
l 一年后，該課題組又相繼發表兩篇文章，通過CRISPR-Cas9技術構建了睡眠紊亂與精神相關異常的BMAL1敲除猴[4]，隨后將BMAL1敲除猴的皮膚成纖維細胞作為細胞核供體通過體細胞核移植的方法獲得了遺傳背景一致的疾病敲除猴模型（見圖1b）[5]，為非靈長類動物疾病模型的構建及在臨床研究中的應用奠定了堅實的基礎。
l 2018年1月12日，Cell
Research雜志同時發表了兩篇來自中國科學家的研究工作，報道了世界首例基因敲入食蟹猴的誕生。其中來自中科院神經科學研究所的楊輝研究組利用之前開發的一種同源末端介導整合(HMEJ)的方法，以胚胎原核注射方式通過優化注射條件首次成功獲得了ACTb-T2A-mcherry基因定點敲入食蟹猴（見圖2），并證實這些猴子具有生殖遺傳的可能。這一研究為通過提高整合效率來構建基因敲入猴提供了新的解決思路[6]。
另一項研究則由早年利用CRISPR技術成功構建基因敲除食蟹猴的季維智院士團隊合作完成，他們基于之前利用CRISPR-Cas9在大鼠上進行精確基因編輯的技術進一步拓展到食蟹猴中，成功獲得了Oct4最后一個密碼子后定點整合GFP的食蟹猴，并檢測到少許的錯配以及脫靶現象。這項研究證明了靈長類動物可成功進行精確基因編輯的可行性，為靈長類動物的重編程研究提供了一種通用的工具[7]。
l 2018年8月23日，中國科學院干細胞與再生創新研究院的研究團隊在Nature發文，首次實現了在非人靈長類動物中全身敲除SIRT6，獲得了世界上首例特定長壽基因敲除的食蟹猴模型（見圖3），確定了SIRT6在非靈長類動物中的生物學功能。研究的結果表明，SIRT6參與調節非人靈長類動物的發育，SIRT6的缺乏會導致胎兒在子宮內發育延遲。這一模型的建立可能為模擬和研究人圍產期致死綜合征的發病機制開辟了新的途徑[8]。
二、單堿基基因編輯技術的優化
單堿基基因編輯技術是指能在基因組上引起單個堿基改變的基因編輯技術。基本原理是將胞嘧啶脫氨酶（APOBEC）或腺苷脫氨酶與現存Cas9n(D10A)融合而形成，依賴于CRISPR原理使得靶點遠離PAM端的4-7位的單個堿基發生修改的基因編輯技術。單堿基編輯系統以其不用切割基因組就能實現堿基的置換而被作為目前最為安全有效的基因編輯工具，但其編輯范圍、編輯窗口、編輯效率以及特異性等未完善的問題仍然需要進一步地改造和優化。
xCas9: Cas9快速進化系統擴大堿基編輯工具靶向范圍
2018年2月，David Liu 實驗室在Nature發文，使用噬菌體輔助的連續進化系統進化Cas9從而獲得了一種能識別多種PAM的SpCas9變體( xCas9 )，它可以識別包括NG、GAA和GAT在內的多種PAM序列，可以靶向人類基因組范圍內約1/4的靶點。xCas9支持在人類細胞中的多種應用，包括靶向轉錄激活、核酸酶介導的基因敲除以及胞苷和腺嘌呤堿基編輯。相比spCas9，xCas9具有更高的DNA特異性，且當用非NGG PAMs靶向基因組位點時，xCas9也表現出極低的非靶向活性。這些發現擴大了CRISPR系統的DNA靶向范圍，與ABEs 融合，也同樣使ABEs PAM的選擇更加靈活[9]。
2. dCpf1-BEs：一種能夠識別富含T的PAM的堿基編輯器
2018年5月，上海科技大學陳佳實驗室在Nature
Biotechnology發文，通過將大鼠胞嘧啶脫氨酶APOBEC1融合到催化失活的Cpf1中，開發了一種基于CRISPR-Cpf1的dCpf1-BEs，從而克服了目前BEs僅能靶向富含G/C的PAM序列的限制，使之能夠識別富含T的PAM序列，并催化人體細胞中的C
- T轉換，同時產生較低的編輯副產物，具有更高的編輯精度。這些發現為堿基編輯系統的全面深入應用提供了新思路、拓展了應用范疇[10]。
3. BE4max 和ABEmax：優化堿基編輯器解決表達水平的技術瓶頸
2018年5月，David Liu實驗室在Nature biotechnology繼續發文，認為表達水平是堿基編輯器的技術瓶頸，通過引入核定位信號( NLS )和密碼子優化，以及脫氨酶組分的原始重建，優化胞苷( BE4 )和腺嘌呤( ABE7.10 )堿基編輯器，獲得了編輯效率更高的BE4max 和ABEmax，分別提高1.9倍和1.3-7.9倍。優化的堿基編輯器可校正致病性SNPs，大大提高了在各種哺乳動物細胞中的編輯效率[11]。
4. BE-PLUS：新型堿基編輯工具具有更寬的編輯窗口和更高的保真度
2018年 7月，陸軍軍醫大學陳潔平課題組和上海科技大學黃行許課題組合作在Cell
Research上發文，開發了一種新的編輯技術BE-PLUS，將10個拷貝的GCN4肽融合到nCas9 ( D10A )中，向靶位點招募scFv
- APOBEC - UGI - GB1，從而更大范圍地進行C to U ( T
)的編輯，極大地拓展了堿基編輯器的編輯窗口。新系統通過擴大窗口實現了堿基編輯，從而擴大了基因組的靶向范圍，并且還能提高保真度[12]。