基因芯片與RNAseq的比較分析

基因芯片 vs RNA-seq哪個好 ？

最近幾年二代測序（又叫NGS）很火，而且價格越來越便宜，原來都用芯片檢測mRNA、miRNA、LncRNA表達量的，好像不少都換用RNA-seq了。那么，到底選擇哪種更好呢？今天就來回答下這個問題。一句話—— 看研究目的。

常見誤區一：

測序的準確性高，獲得的信息更豐富

對，但又不對。 

首先，大家需要明確，檢測到和準確分析基因表達量的概念是不同的，只有mapping到基因上的reads達到一定數量，才能得到相對準確的分析結果。因此RNA-Seq能檢測到多少可靠的信息完全取決于測序深度，測序深度，測序深度！不同于芯片的雜交法，RNA-seq是通過讀數來檢測，讀數多（即測序深度深）代表著RNA-seq的采樣率高。采樣率低了準確度自然就低了。

那么有沒有一個實驗能說明芯片和RNA-seq之間數據準確度的差異呢？

發表在PNAS上面的這篇文章就幫大家做了一個對比（PNAS 2011, 108(9):3707-3712.）。圖中綠色點/黑色線是測序得到的數據，紅色點/紅色線是芯片得到的數據。在～50M reads數據量的情況下，當基因表達豐度較高時（橫坐標RPKM較大時），兩者之間的數據質量都是非常好的（縱坐標CoV即變異系數越小，數據質量越高），但當基因表達豐度變低時（橫坐標RPKM較小時），RNA-seq的數據質量就急劇下降了，而芯片則仍然維持著高水準。這篇文章得到的結論是：～80%以上的基因，RNA-seq的數據質量/可信度都低于芯片。市場上最流行的的6G數據量的RNA-seq，其實就是40M reads或者20M paired reads，對于研究高表達豐度的基因來說，差不多是夠用了。但是對于中、低表達豐度轉錄本就不夠用了。

常見誤區二：

RNA-seq可以同時檢測已知和未知基因，基因芯片只能檢測已知基因，這是一個巨大的局限。

首先，這個觀點的一個潛在假設是，每次測序都能夠發現一些未知分子。但對于人、大鼠、小鼠以及其他一些模式生物，該發現的基因基本上都已經發現完了。因此基因是否已知，在很多情況下并非重點，重點在于該基因在您研究的領域中功能是否已知。芯片上已知基因的功能大多都還不清楚，只是盲目地去追求發現新分子并不可取。

在探索性研究和非模式生物研究中，RNA-seq才是更合適的選擇。

常見誤區三：

RNA-seq現在已經很便宜了，比基因芯片還便宜很多。

測序中收費標準之一來源于數據量（即測序深度），剛剛說了，市場上最流行的的RNA-seq服務數據量是6G/樣本，即40M reads或者20M paired reads ，這時候確實比很多芯片都便宜了。但是如果希望更準確檢測中、低豐度RNA，就需要更深度的測序保證數據可靠性，這就會導致測序成本急劇上升。下表幫大家總結了一些常見研究的測序數據要求。Nature biotechnology有篇文章指出，如想要檢測lncRNA、轉錄異構體等一般表達豐度極低的轉錄本，至少需要300M reads的測序量才能達到80%的數據準確度（Nature biotechnology, 2014, 32(9): 903-914.）。

那么芯片又如何呢？拿Affymetrix HTA系列的芯片來說，它的數據量，可是相當于480M reads測序深度！哇，好像看到了好多錢 

常見誤區四：

RNA-seq在測表達量的同時還可以發現突變，基因芯片不能。

基因芯片（這里專指測RNA的表達譜芯片）確實不能發現突變。RNA-seq是通過測序來檢測RNA豐度的，確實可以獲得序列信息，但是因為測序本身有錯誤率，而RNA-seq常做的測序深度很低，得到的突變信息其實并不準確。要想準確，就需要極高的測序深度，那么又回到老問題了，成本基本是不可接受的。