問題 | 可能原因 | 解決方案 |
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雜交點模糊、毛邊 | DNA濃度過高 | 降低DNA探針濃度進行芯片的打印 |
紫外交聯時未能有效固化DNA | 檢測紫外燈，將其能量值調試至合適值；將打印好的芯片置80℃烤2~4h。 | |
雜交時蓋片移動 | 雜交時將蓋片放正，雜交過程中避免其移動；預先用水和普通載玻片練習放置蓋玻片。 | |
沒有進行封閉，或封閉不完全 | 用琥珀酸酐進行封閉 | |
各點形狀不規則 | 打印針頭折斷或彎曲 | 檢查打印針頭，更換已彎曲的針頭 |
針頭不干凈 | 清潔打印針頭 | |
針頭打印點后向上移動速度太快 | 減少針頭從打印點向上移動的距離約25% | |
背景區出現熒光點 | 樣品核酸中摻入的熒光染料過多或過少 | 每份樣品核酸應含約20pmol/L的熒光染料；雜交前應檢測樣品核酸的特異活性，應達到平均每25~50個核苷酸含1個染料分子。 |
樣品核酸的熒光衰減 | 熒光染料及標記好的樣品核酸應避光保存 | |
芯片打印或雜交時污染了手套上的粉塵 | 芯片制備和檢測的所有過程中應使用無粉塵的手套 | |
芯片上沾染了空氣中灰塵 | 在無塵工作櫥或環境中操作 | |
未摻入樣品核酸的熒光染料在芯片上的非特異性結合 | 純化標記樣品核酸時，建議采用PCR純化試劑盒，勿用0.5ml超離心裝置。 | |
雜交前cDNA樣品應充分熱變性，保證成單鏈狀態。 | ||
高背景或背景不均勻 | 雜交時，蓋片與芯片間出現氣泡，氣泡部位樣品核酸不能與芯片上的DNA雜交 | 小氣泡會在雜交過程中自然消失，無需處理。 |
傾斜芯片或蓋片，使得氣泡移動到上部后自然消失。 | ||
雜交前先用水和普通玻片練習如何正確放置蓋玻片。 | ||
采用疏水性（聚丙烯）蓋玻片（如Grace Biolabs的HS-66 22mm×60mm蓋玻片）。 | ||
雜交后清洗不充分（這種情況經常出現） | 每次清洗均應使用新鮮配制的溶液。200ml清洗皿中最多同時洗4張芯片。 | |
嚴格按操作說明洗夠充足的時間和次數。 | ||
樣品溶液中混有未結合熒光染料的核酸 | PCR純化柱用前應按說明進行酸化，勿用0.5ml超離心裝置 | |
雜交時間過長 | 減少雜交時間。通常6~8h已足夠。 | |
因樣品核酸標記時熒光染料的摻入不足，為增強雜交信號而加入過多樣品 | 雜交前應檢測樣品核酸的活性，應達到平均每25~50個核苷酸含1個染料分子 | |
打印好的芯片保存不當 | 打印好而暫時不做雜交的芯片應立即置于專用盒中，鋁箔密封，再放入干燥器中 | |
出現異常雜交模式 | 與不同樣品雜交的芯片在同一緩沖液和清洗液中清洗 | 不同樣品雜交的芯片應單獨清洗，均用新鮮清洗溶液 |
蓋片周圍出現相同的強熒光信號 | 雜交時樣品核酸溢出 | 確保雜交時濕度適宜。蓋玻片的放置一定要到位。增加樣品核酸用量。 |