基因表達差異分析方法進展

  高等真核生物的基因組一般具有80 000～100 000個基因，而每一個細胞大約只表達其中的15%［1］。基因在不同細胞間及不同生長階段的選擇性表達決定了生命活動的多樣性，如發育與分化、衰老與死亡、內環境穩定、細胞周期調控等。比較細胞間基因表達的差異為我們揭示生命活動的規律提供了依據。

　　由于真核細胞mRNA 3′端一般含有Poly（A）尾，因此現有的方法基本上都是利用共同引物將不同的mRNA反轉錄成cDNA，以cDNA為對象研究基因表達的差異。1992年 Liang等［2］建立了一種差異顯示反轉錄PCR法（differential display reverse transcription PCR，DDRT-PCR），為檢測成批基因表達的差異開辟了新天地。迄今為止已出現了大量應用該技術的研究報道［3，4］。然而，盡管應用DDRT-PCR方法已經取得了不少成果，而且該方法還在不斷改進之中，但它仍然存在幾個難以解決的問題：(1) 重復率低，至少有20%的差異條帶不能被準確重復［5］；(2) 假陽性率可以高達90%［6］；(3) 獲得的差異表達序列極少包含編碼信息。近年來，針對DDRT-PCR方法的不足，又有幾種新的檢測差異表達基因的方法出現，現僅就這方面的進展做一簡要介紹。

　　1.基因表達指紋（gene expression fingerprinting，GEF）：GEF技術使用生物素標記的引物Bio-T13合成cDNA第一鏈，用dGTP對其進行末端加尾，再以富含C的引物引發合成cDNA第二鏈。用限制性內切酶消化雙鏈cDNA，以交聯有抗生物素蛋白的微球捕獲cDNA3′端，以T4DNA連接酶連接同前述內切酶相對應的適配子，并以Bio-T13及適配子中的序列作為新的引物進行特異的PCR擴增，得到大量的特異cDNA片段。適配子末端被32P-dATP標記后，固定于微球上的cDNA片段經過一系列酶切，產生的酶切片段從微球表面釋放出來，其中那些含有標記末端的片段經凝膠電泳后構成mRNA指紋圖譜。通過分析不同細胞間的指紋圖譜就能得到差異表達的序列［7］。GEF技術所需的工作量較DDRT-PCR明顯減少，由于用酶切反應替代了條件不嚴格的PCR反應，其重復性也較好，假陽性率低，并且所獲得的片段中包含有一定的編碼信息。GEF技術最大的缺點在于電泳技術的局限。由于它的指紋圖譜要顯示在同一塊電泳膠上，經過幾輪酶切之后常會得到1 000～2 000條電泳帶，而現有的PAGE電泳很少能分辨超過400條帶，故只有15%～30%的mRNA能夠被辨認出來，因此得到的只能是高表達基因。如果希望尋找部分新基因，這是一種比較簡單有效的方法；如果希望得到有關某種細胞的基因表達譜，可能比較困難；采用雙向電泳技術可能會有所幫助［8］。

　　2．基因表達系統分析（serial analysis of gene expression，SAGE）：SAGE法的建立基于兩條理論。首先，一段來自某個轉錄子確定位置的核苷酸，其長度只要有9～10個bp，就能夠特異地確認該轉錄子。第二，對短片段標簽的鏈接有利于在同一克隆中對多個標簽測序。SAGE也是用生物素標記的Bio-Oligo(dT)為引物合成雙鏈cDNA，然后以限制酶（錨定酶）進行酶切，捕獲cDNA3′端。在此處產物被分為兩部分，分別與包含有IIS型內切酶（標簽酶）位點的A、B連接子相接。IIS型內切酶的特點是作用位點處于識別位點之外。這樣經過酶切，就有可能得到只有9～10bp的標簽序列。每兩個標簽的鈍端結合后成為PCR的模板，以基于A、B連接子的引物進行PCR反應的結果是得到了大量每條包含兩個不同來源標簽的序列，接下來再用錨定酶酶切、連接，就能將多個不同的標簽鏈接在一起（大約為每條包含數十個不同來源的標簽），克隆至質粒載體中后集中測序［9，10］。SAGE的最終結果是通過計算機統計得到的，根據某個標簽出現頻率的高低來判斷并計算其所屬基因表達的豐度。對于在數據庫中找不到對應序列的標簽，還可以利用13bp的寡核苷酸探針（9bp加上錨定酶識別位點的4bp）對cDNA文庫進行篩選，以尋找新基因。SAGE可以檢測不同細胞間已知基因表達的具體差異，精確到每個細胞中大約有多少拷貝，可以建立較全面的基因表達譜，系統地分析基因表達的差異。它的缺點在于工作量非常大，有大量的測序及計算機分析任務；而且，對于尋找新基因而言，僅用長度為13bp的寡核苷酸探針篩選cDNA文庫是很不嚴格的，根據我們的經驗，往往是假陽性結果居多。

　　3 . cDNA3′端限制酶切片段顯示（display of 3′ end restriction fragments of cDNAs）:cDNA3′端RFD利用帶有“踵”結構的錨定Oligo(dT)引物合成cDNA第一鏈，以Okayama和Berg的置換法合成cDNA第二鏈，然后將雙鏈cDNA以限制酶消化。本方法的適配子由A1和A2兩條寡核苷酸構成，其序列與所用限制酶識別位點相符合，先將A2的5′端磷酸化，再加入A1退火，就會形成一個Y型結構；把Y型適配子與酶切后的cDNA片段相連接，以適配子及錨定引物中所含序列為特異引物進行PCR反應，則只有cDNA3′末端的一段被擴增出來，這時的產物可用凝膠電泳表示出來構成差異表達圖譜。對于每次切割6bp的限制酶來說，每種大概只能切割8%的cDNA，因此至少需要12種以上的限制酶才能使所有cDNA都顯示出來［11］。cDNA3′端RFD與GEF的思路比較相似，由于它利用多種限制酶進行酶切，因此不會象GEF因凝膠電泳分辨率不夠而漏掉信息。它的重復性較好，假陽性率低，尤其是對于已知基因，可以根據選擇內切酶的作用位點確定該基因在凝膠電泳中的位置并判斷其含量，從而避免了進一步的分析。對于精力有限的研究人員，這可能是個值得一試的方法。cDNA3′端RFD方法也存在一些和DDRT-PCR相類似的缺點，它得到的片段中包含的編碼信息比較少，需要多花一些時間對所得到的差異條帶進一步分析。

　　4.分子指數的RNA指紋（RNA fingerprinting by molecular indexing，MI）:MI是一種能夠較好地顯示mRNA中編碼序列的方法。它利用Ⅱs型內切酶的作用位點在識別位點之外可以形成一個4bp的突出端的特點，設計43共64種（最外側一個核苷酸隨機）適配子，使得獲取編碼序列片段成為可能。首先是以常規方法合成雙鏈cDNA，用Ⅱ類限制酶進行酶切后連接5′端磷酸化的相應適配子，再以Ⅱs類內切酶酶切后形成一個隨機的4 bp突出端，用連接有生物素的64種適配子予以結合，可將這些限制片段分為64類，用包被抗生物素蛋白的磁珠捕獲連接產物，就可以利用前后兩個適配子所攜帶的特異序列為引物進行PCR擴增反應，凝膠電泳顯示表達差異［12］。 由于擴增的序列位于cDNA內部，因此最后得到編碼序列的可能性很大，這是該方法最大的優點。鑒于并不是所有cDNA都含有某一識別位點，故采用不同的內切酶組合。理論上可以顯示所有的差異表達基因，但這樣一來工作量就變得十分巨大。因此，該方法只適合對樣本的快速分析和部分差異表達基因的研究；如果要對某種細胞的基因表達進行全面的研究，可能還要采用其它的方法。

　　5.抑制性消減雜交（suppression subtractive hybridization，SSH）: SSH方法源于代表性差異分析法（representational difference analysis, RDA）。它原是一種研究基因組之間差異的以雜交為基礎的方法。Diatchenko等［13］將“抑制性PCR”理論［14］與RDA相結合，建立了一種分離差異表達基因的新方法。SSH將需要檢測的細胞稱為“檢測子”，將對照細胞mRNA稱為“驅趕子”，把mRNA合成cDNA后，通過僅僅兩輪雜交和PCR過程，就能有效地分離到在檢測子中表達，而在驅趕子中不表達或表達豐度不同的mRNA（圖5）。通過SSH有可能得到某種細胞中相對其他組織的差異表達基因的全面信息，它較好地克服了其它方法中低豐度基因難以得到的問題，據稱對低拷貝基因的富集可以達到1 000～5 000倍，因此可能發現一些用原有方法沒有檢測到的新基因。這方面已經有人進行了嘗試［15，16］，獲得了一些成果。SSH的不足之處在于它需要mRNA的量較大，檢測子和驅趕子都要達到2微克以上，這在某些情況下是非常難以做到的，因此目前有關SSH的報道基本上都以腫瘤細胞為研究對象。

　　基因表達差異的研究方法在DDRT-PCR出現之后又有了很大的發展，每種方法都各有自己的優缺點，研究人員應該根據自己的側重點選擇適合于自己的方法。目前真正能夠做到簡單、準確、全面地揭示基因表達差異的方法仍在不斷探索之中，因此許多研究機構仍采用DDRT-PCR來達到自己的目的，畢竟經過最近數年的完善，該技術在許多方面都有了一定的改進，完成一般的研究項目已是綽綽有余。SSH作為一種基因表達差異研究的新方法，假陽性率低，所得到的結果也更加全面，因此，希望以不太復雜的方法全面揭示差異表達基因的研究者，可以嘗試一下這種方法。

　　作者單位：200433　上海，第二軍醫大學長海醫院燒傷中心

　　參考文獻

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　　3　Diachenko LB, Ledesma J, Chenchik AA, et al. Combining the technique of RNA fingerprinting and differential display to obtain differentially expressed mRNA. Biochem Biophys Res Comun, 1996, 219: 824-828.

　　4　Adati N, Ito T, Koga C, et al. Differential display analysis of gene expression in developing embryos of Xenopus Laevis. Biochem Biophys Acta, 1995,1262:43-51.

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　　9　Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, et al. Serial analysis of gene expression. Science, 1995,270:484-487.

　　10　Velculescu VE, Zhang L, Zhou W, et al. Characterization of the yeast transcription. Cell, 1997,88:243-251.

　　11　Prashar Y, Weissman SM. Analysis of differential gene expression by display of 3′ end restriction fragments of cDNAs. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:659-663.

　　12　Kato K. RNA fingerprinting by molecular indexing. Nucleic Acids Res, 1996,24:394-395.

　　13　Diatchenko L, Lau YF, Campbell AP, et al. Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:6025-6030.

　　14　Siebert PD, Chenchik A, Kellogg DE, et al. An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucleic Acids Res, 1995, 23:1087-1088.

　　15　Vonstein OD, Thies WG , Hofmann M. A high throughput screening for rarely trancribed differentially expressed genes. Nucleic Acids Res, 1997,25:2598-2602.

　　16　Kuang WW, Thompson DA, Hoch RV, et al. Differential screening and suppression subtractive hybridazation identified genes differentially expressed in an estrogen receptor-positive breast carcinoma cell line. Nucleic Acids Res, 1998,26:1116-1123.

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