1.為移植開始培養基因修正的細胞,收獲 80%~90% 的匯合度的細胞。手術時,當麻醉和準備動物的時候準備好懸浮細胞(支持方案)。手術期間,每 30~60 min 重懸細胞。
2.參考鼠腦圖像決定注射位置,通過 anterior-posterior 和 medial-lateral 坐標假定腦功能區定位支架的前肉點,通過垂直坐標假定硬腦脊膜。
3.麻醉一個成年的宿主,注射 0.25 ml 麻醉液,每 160 g 體重和標記動物加 1 個耳打孔器或耳標。
4.放置好一個麻醉小鼠在一個腦功能區定位區域。以維持嚙鼠動物腦在正確的位置,插人耳棒,小心在計算好的刻度上系緊。準確放置口棒。
5.在皮膚上開個小口,位于眼耳中線。用 10 號解剖刀分開皮膚并清潔皮膚,去除血和粘連組織。
6.確定前肉點,確定坐標,在頭蓋骨上開一個 1mm 直徑的孔,用 26G 針切除硬腦脊膜。
7.用吸管輕輕吹打以重新分開細胞懸液。吸 1~3ul 75000~300000 個細胞每注射點。在腦功能區定位支架上裝好帶有 5ul 漢密爾頓注射器的電操縱器,并避免氣泡。
8.輕輕注射溶液,并使注射速度低于 1ul/min。當注射完畢時,抬起針頭 1 mm,靜置 2 min,收針。
9.如果多于兩個注射點,在新坐標上再打一個 1 mm 直徑的孔,重復注射操作。避免每只小鼠注射量大于 10ul。
10.拿開小鼠,清潔頭蓋骨,用抗菌素消毒。用傷口架子夾緊皮膚,把動物轉移至恢復籠子。
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