基本原理是將樣品分散在基質分子中并形成晶體。當用激光照射晶體時，基質從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質-樣品之間發生電荷轉移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場作用下飛過真空的飛行管，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測，即通過離子的質量電荷之比（M/Z）與離子的飛行時間成正比來分析離子，并測得樣品分子的分子量。例如，檢測DNA樣品時，DNA離子按其質量大小先后通過檢測器，DNA片段越短，越早到達檢測器。
