增加PCR特異性

引物設計  

細心地進行引物設計是PCR中zui重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。下面的指導描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點： 

1.典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。

2.選擇GC含量為40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。 

3.設計5'端和中間區為G或C的引物。這會增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。 

4.避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。

5.避免3'末端富含GC。設計引物時保證在zui后5個核苷中含有3個A或T。

6.避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。

7.避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩定性。 
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當計算引物Tm值時并不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。 
有時候，對于引物設計僅了解有限的序列信息。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設計兼并引物。兼并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的堿基使用偏好，減少兼并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用兼并堿基，因為3'端zui后3個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因為許多兼并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。  

引物退火溫度

引物的另一個重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。 
    設定Tm有幾種公式。表4列出確定引物Tmzui常用的兩種方法。*個公式來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。第二個公式根據GC含量估算Tm。確定引物Tmzui可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。 
    根據所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。為獲得zui佳結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比zui低的Tm低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環，然后在根據較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。  

遞減PCR  

遞減PCR通過在PCR的前幾個循環使用嚴緊的退火條件提高特異性。循環開在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個循環降低1℃到2℃，直到退火溫度低于Tm 5℃。只有同同源性zui高的目的模板會被擴增。這些產物在隨后的循環中繼續擴增，并會將擴增的非特異性產物排擠出去。遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法較為有用，如AFLP DNA指紋分析。  

引物濃度

引物的濃度會影響特異性。zui佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會導致非特異性產物擴增。 
    為了確定引物濃度，可以在260nm（OD260）測量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數的倒數（nmol/OD），通過Beers法則（公式1）計算引物濃度。微摩消光系數可以使用公式2計算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數不同，確定引物的精確濃度必須使用計算的消光系數。這是因為引物較短，堿基組成差異很大。在Gibco/BRL定制引物的質檢報告中包含了消光系數（OD/μmol）和消光系數的倒數（μmol/OD）。另外，不要使用寡聚核苷酸作為標準，在EB染色的膠上估算引物濃度，因為引物和標準的染色能力根據序列不同而差異很大。  

引物純度和穩定性  
    定制引物的標準純度對于大多數PCR應用是足夠的。因脫鹽而除去的苯甲酰基和異丁酰基很少，因此不會干擾PCR。部分應用需要純化，以除去在合成過程中的任何非全長序列。這些截斷序列的產生是因為DNA合成化學的效率不是100％。這是個循環過程，在每個堿基加入時使用重復化學反應，使DNA從3'到5'合成。在任何一個循環都可能失敗。較長的引物，尤其是大于50個堿基，截斷序列的比例很大，可能需要純化。 
    引物產量受合成化學的效率及純化方法的影響。Life Technologies以一個zui小OD單位確保總寡核苷的產量。定制引物以干粉形式運輸。zui好在TE重溶引物，使其zui終濃度為100μM。TE比去離子水好，因為水的pH經常偏酸，會引起寡核苷的水解。 
    引物的穩定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）zui多可以保存2個月。  

熱啟動  
    熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性zui重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的zui佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應配制過程中，以及在熱循環剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產生非特異性的產物。這些非特異性產物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構建和操作，熱啟動PCR尤為有效。 
    限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應液，并將其置于預熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產物的擴增。 
    熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶在內的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其是對高通量應用。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應用。      Platinum DNA聚合酶對于自動熱啟動PCR來說方便高效。Platinum Taq DNA聚合酶的成分為復合有抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體的重組Taq DNA聚合酶。抗體在PCR配制，以至于在室溫的延時保溫過程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在變性步驟的94℃保溫過程中被釋放到反應中，恢復了完全的聚合酶活性。同經化學修飾用于熱啟動的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延時保溫（10到15分鐘）以激活聚合酶。使用PlatinumTaq DNA聚合酶，在94℃進行2分鐘就可以恢復90％的Taq DNA聚合酶活性。  

鎂離子濃度  

    鎂離子影響PCR的多個方面，如DNA聚合酶的活性，這會影響產量；再如引物退火，這會影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結合，降低了酶活性所需要的游離鎂離子的量。zui佳的鎂離子濃度對于不同的引物對和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始濃度是1.5mM（注意：對實時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液）。較高的游離鎂離子濃度可以增加產量，但也會增加非特異性擴增，降低忠實性。為了確定zui佳濃度，從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進行鎂離子滴定。為減少對鎂離子優化的依賴，可以使用Platinum Taq DNA聚合酶。Platinum Taq DNA聚合酶能夠在比Taq DNA聚合酶更廣的鎂離子濃度范圍內保持功能，因此僅需較少的優化.  

促進PCR的添加劑  

    退火溫度，引物設計和鎂離子濃度的優化足以對大多數模板進行高特異性的擴增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影響DNA熔解溫度的添加劑提供了提高產物特異性和產量的另外一種方法。為獲得zui好的結果需要模板的完全變性。另外，二級結構會阻止引物結合和酶的延伸。PCR添加劑，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿以及PCRx Enhancer Solution可以增強擴增。它們可能的機理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級結構區。PCRx Solution還有其他優點。在同Platinum Taq DNA聚合酶和Platinum Pfx DNA聚合酶一起使用時，僅需很少的鎂離子優化。這樣，將Platinum技術同添加劑結合，增強了特異性，同時減少了第三種方法-鎂離子優化的依賴。為獲得zui佳結果，應優化添加劑的濃度，尤其是會抑制Taq DNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。 

巢式PCR  

    使用巢式引物進行連續多輪擴增可以提高特異性和靈敏度。*輪是15到20個循環的標準擴增。將一小部分起始擴增產物稀釋100到1000倍加入到第二輪擴增中進行15到20個循環。或者，也可以通過凝膠純化將起始擴增產物進行大小選擇。在第二輪擴增中使用一套巢式引物，其可以同*套引物內側的靶序列結合。巢式PCR的使用降低了擴增多個靶位點的可能性，因為同兩套引物都互補的靶序列很少。而使用同樣的引物對進行總數相同的循環（30到40）會擴增非特異性靶位點。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5' RACE）的特異性。