外顯子捕獲與擴增1

大腸桿菌菌株 HB101質粒 pSPL3COS-7 細胞載體 pBluescriptⅡ大腸桿菌 DH5α

pSPL3 多克隆位點圖譜限制性內切核酸酶PvuⅡT4DNA 連接酶LB 瓊脂平板黏粒載體TESOC 培養基瓊脂糖凝膠LB 肉湯培養基PBS胰酶-EDTA 溶液DNADMEMDEPC 處理水乙醇NaClTMK 緩沖液SDSDTTdNTP 溶液Bst XIEcoR VMo-MLV 反轉錄酶Taq DNA 聚合酶DNA 尿嘧啶糖基酶RNase 抑制劑

水浴箱離心轉頭電穿孔轉染設備以電轉染槽組織培養平皿寬口加樣器頭細胞刮子或橡膠刮聚苯乙烯離心管熱循環儀多通道加樣器或加樣裝置

階段 1: 文庫的構建

材料

緩沖液與溶液
按合適比例稀釋貯存液。

ATP(10 mmol/L)

酚：氯仿（1:1,V/V)

TE(pH8.0)

酶及緩沖液

PvuⅡ

限制性內切核酸酶

pSPL3 多克隆位點圖譜見圖 11-16

T4DNA 連接酶

凝膠

瓊脂糖凝膠（0.9%m/V), 用 TAE 配制
見步驟 3

瓊脂糖凝膠，預制
見步驟 1

核酸與寡核苷酸

黏粒載體、大腸桿菌人工染色體或酵母人工染色體 DNA, 含有靶標基因組 DNA 區域。
用于分析的重組子 DNA 純化方法見第 4 章。
或基因組 DNA
按第 6 章提供的方法之一制備

培養基

含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板
參見步驟 8 決定平板的合適規格。

含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 肉湯培養基

SOC 培養基

專用設備

預設溫度為 15°C 和 65°C 的水浴

附加試劑

本方案步驟 8 需要的試劑列在第 1 章，方案 20。
本方案步驟 6 需要的轉化所需試劑列在第 1 章，方案 23、24 或 25。
本方案步驟 10 和 12 需要的試劑列在第 1 章，方案 1 或 9。

載體與菌株

大腸桿菌菌株 HB101, 處于轉化感受態
按第 1 章，方案 23,24 或 25 制備。

質粒 pSPL3
Life Technologies 公司提供單獨的或作為試劑盒組分的質粒 pSPL3。

方法

1. 對 pSPL3 進行限制酶切以插入基因組 DNA(pSPL3 多克隆位點圖譜見圖 11-16)。對線性化的質粒 DNA 去磷酸化處理，電泳并從凝膠中回收純化質粒。
質粒 DNA 酶切完全非常重要，產物應為大小約 6kb 的單一片段。

2. 用與上一步相同的限制酶消化 1~2ug 的基因組 DNA 或含有目的基因組 DNA 的重組質粒。

3. 用 0.9% 的瓊脂糖凝膠電泳（TAE 體系）分析 10% 的基因組酶切產物。
基因組 DNA 須酶切完全而無降解。凝膠電泳分析時，注意觀察有無污染細菌（或酵母）基因組 DNA, 污染的 DNA 通常呈彌傲的背景條帶。

4. 將基因組 DNA 酶切體系置 65°C15 min 終止酶切反應，酚: 氯仿抽提并用標準的乙醇沉淀法回收 DNA。產物溶于 TE(pH8.0), 濃度為 100ug/ml。

5. 混合以下組分將基因組 DNA 連接到載體上：

酶切后的基因組 DNA                               150ng
酶切并經去磷酸化的 PSPL3                     50ng
10x 連接反應緩沖液                                 1ul
T4 噬菌體 DNA 連接酶                             10Weiss 單位
加 H₂O 至                                                 10ul
室溫溫育 2~3 h 或 15°C 過夜。
10X 連接反應緩沖液組分已添加 ATP, 則反應混合物中可加入更大體積的載體或外源 DNA。使用商品化的含 ATP 的連接續沖液，則無須添加 ATP。確保引入只有載體 DNA 的對照，這對于評價構建的文庫的質量非常重要。

6. 用連接反應產物轉化 40ul 的 HB101 感受態細胞。
確保用陽性對照（載體 DNA) 和陰性對照（無 DNA 體系）同時轉化以評價轉化效率。
重要：由于在其他菌株中 pSPL3 復制不穩定，使用 HB101 作為文庫和載體擴增的宿主是必須的（Churchand Buckler1999)。

7. 轉化后菌液中加入 800ul 的 SOC 培養基，37°C 培養 30~45 min 使質粒編碼的抗生素抗性標記基因表達。

8. 在氨芐青霉素存在下 37°C 搖菌過夜以擴增文庫。
如使用單個黏粒：將 100ul 轉化混合物涂布一個含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板。剩余的加入含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 肉湯液體培養基 2 ml 繼續培養。
取小量轉化物在 LB 平板上培養可評價轉化效率。

如使用 BAC、PAC 或黏粒庫：將所有轉化混合物涂布在多個 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板（150 mm) 上。
這樣處理是為了消除因營養競爭而導致的某些克隆的優勢生長，使構建的文庫更具代表性。

9. 通過比較重組子與非重組子數目估計連接效率（也就是與只有 pSPL3 的連接混合物轉化 HB101 所得克隆數進行比較)。
重組子至少應達到非重組子的 500 倍到 1000 倍。

10. 如在 150 mm 平板上進行文庫擴增，直接進入步驟 11。對于在液體肉湯培養基中擴增的基因組文庫，用標準的堿變性法（見第 1 章，方案 1) 或質粒提取試劑盒純化質粒，然后進入步驟 13。

11. 如整個庫鋪在大的 LB 瓊脂平板上，則加入 10 ml 肉湯培養基浸沒平板，并小心從瓊脂表面將菌落刮下來，盡量減少刮入肉湯中的瓊脂量。

12. 用經過修改的標準堿變性法小量質粒提取程序純化步驟 11 中獲得樣品中的質粒，依次加入細菌沉淀中的試劑量調整為堿裂解液Ⅰ(300ul), 裂解液Ⅱ(600ul) 及裂解液Ⅲ(450ul)。為簡化程序，在加入堿裂解液 I 后，將細菌懸液移入一個 2 ml 離心管中，這樣其余程序可在此離心管中完成。在加入溶裂解液Ⅲ并離心后，將粗制的質粒上淸分為兩份置于兩個 1.5 ml 離心管中。用酚：氯仿及氯仿對上清進行抽提，獲得的上清用異戊醇沉淀，最后合并兩管中的 DNA 重懸液。也可用商品化的質粒提取試劑食完成此步（第 1 章，方案 9)。

13. 取部分純化后的質粒 DNA 用 PvuⅡ進行酶切，通過電泳觀察構建的文庫質量。
PvuⅡ酶切位點靠近質粒的多克隆位點。空載體酶切產物電泳顯示 4kb 和 2kb 的條帶。童組克隆經切割仍可見明顯的 4kb 條帶，但 2kb 的條帶則應很微弱或沒有。2kb 條帶如很明顯則提示文庫的質量不佳，或者 (但可能性較小）基因組 DNA 經 PvuⅡ切割成大多為 2kb 的片段（圖 11-17)。如文庫的質量令人滿童，則可用于實驗的下一步驟。



階段 2: 電穿孔法將文庫轉染 COS-7 細胞

材料

緩沖液與溶液
按合適比例稀釋貯存液。

無二價陽離子的磷酸緩沖液（PBS）

酶及緩沖液

胰酶-EDTA 溶液

核酸與寡核苷酸

DNA
用于轉染的質粒 DNA 制備見本方案階段 1, 步驟 10~12。

用作對照的質粒載體（步驟 3)

培養基

含 10% 熱滅活胎牛血清的 Dulbecco's modified Eagle's 培養基（DMEM)

離心轉頭

Sorvall H1000B 轉頭或等同規格轉頭

專用設備

電穿孔轉染設備以及 0.4 cm 寬的電轉染槽

組織培養平皿（100 mm)

寬口加樣器頭

細胞與組織

COS-7 細胞
細胞須在含 10% 熱滅活胎牛血清的 DMEM 培養至 75%—85% 致密。關于細胞的處理細節，包括胰酶消化，見 Spector 等（1998b)。

方法

1. 用無二價陽離子的 PBS 洗滌單層 C0S-7 細胞。通過胰酶-EDTA 處理將細胞從平皿表面消化下來。4°C、250 g(Sorvall H1000B 轉頭上相當于 1100r/min) 離心 10 min 回收細胞。
重要：在整個過程中須保持 COS-7 細胞處于預冷狀態。
關于細胞胰酶消化細節見 Spector 等（1998b)

2. 將用于轉染的 DNA 樣品溶于無二價陽離子的 PBS 并調整至 100ul。
轉染所需的 DNA 量應按第 16 章，方案 5 進行優化，

3. 用 700ul 無二價陽離子的 PBS 重懸 4X10⁶COS-7 細胞。在預冷的電轉染槽中混合細胞與 DNA(槽內寬 0.4 cm)。將混合物放置冰上 10 min。
PBS 體系中如含二價陽離子，將導致電轉染時產生電弧，可破壞電穿孔僅。
確保應用空載體 DNA 進行電轉化，作為實驗對照。

4. 小心重懸細胞，按 1.2kV(3kV/cm) 和 25uF 進行電穿孔轉染實驗。迅速將電轉槽重置于冰上，并放置 10 min。
電穿孔轉染條件按第 16 章，方案 5 描述的方法進行優化。

5. 用寬口加樣器頭將 1x10⁶ 的電轉染后的細咆轉入 100 mm 的組織培養平皿中，每個平皿已加入 10 ml 預熱至 37°C 的含 10% 熱滅活胎牛血清的 DMEM 培養基。在設定 37°C、5%~7%CO₂ 及一定濕度的培養箱中培養 48~72 h。