外源基因在原核細胞表達技術

原核細胞
*用IPTG誘導啟動子在大腸桿菌中表達克隆化基因
 含重組表達載體的大腸桿菌菌株的構建
1.PCR修飾或限制性內切酶消化分離DNA片段，片段5’端和3’端帶有與IPTG誘導表達載體對應的限制酶位點。
2.含靶cDNA/基因的DNA片段與表達載體連接。
3.重組質粒轉化有lacI^q 等位基因的大腸桿菌菌株。如果質粒本身有lacI基因，可以使用任何適當的大腸桿菌菌株。將轉化體鋪于含氨芐（50μg/ml）的LB平板，于37℃過夜培養。
4.通過菌落雜交和/或小量制備質粒的限制酶切分析、寡核苷酸雜交或序列分析篩選帶有插入片段的轉化體。
 誘導靶蛋白表達的優化
 許多研究表明細胞生長速率嚴重影響外源蛋白的表達，因此必須對接種菌量、誘導前細胞生長時間和誘導后細胞密度進行控制。生長過度或過速都會加重細菌合成系統的負擔，導致形成包涵體。
5.對照菌和重組菌分別挑取1～2個菌落，接入1 ml含氨芐青霉素（50μg/ml）的LB培養液，適當溫度（20～37℃）培養過夜。
大腸桿菌在室溫的生長速率比在37℃慢4倍，所以～20℃培養過夜（16 h）可能達不到飽和。但低溫時細菌代謝緩慢，不容易形成包涵體。
6.取50μl過夜培養物接入5 ml含氨芐青霉素（50μg/ml）的LB培養液，20～37℃振蕩培養2 h以上，至對數中期（A₅₅₀=0.5～1.0）。
7.吸出1 ml未經誘導的培養物放在一個微量離心管中，按下面步驟9和10所述進行處理。
8.在剩余培養物中加入IPTG至終濃度1 mmol/L，20～37℃繼續通氣培養。
IPTG的濃度對表達水平影響非常大。1 mmol/L只是一個起點，也是一個比較高的濃度。實驗中，應在0.01～5.0 mmol/L的范圍內改變IPTG濃度，尋找最佳使用濃度。對于有些蛋白，必須誘導表達質粒慢轉錄，才不致于使細菌的生物合成系統過載。
影響在大腸桿菌中獲得高水平表達的最重要因素可能是生長溫度，通過實驗確定最佳溫度，是表達外源蛋白的關鍵。雖然在15～42℃之間都獲得過成功表達，但表達某一種特定蛋白質的最佳溫度范圍則可能很窄，只有2～4℃。溫度有時對表達水平起著決定作用，而有時卻對表達水平沒有任何影響，這其中的原因還有待進一步研究，但可能是諸多因素單獨或同時作用的結果。這些因素包括：細菌生長速率、表達產物的胞內折疊、輔基（血紅素、黃素、腺嘌呤二核苷酸、生物素等）的可獲得性、外源蛋白的熱變性、細胞分泌或折疊器的過載、內原蛋白酶或其他裂解酶的活性、細菌SOS修復系統的激活等。由于這些不確定因素的存在，理論推斷最佳生長溫度是不可*的，必須進行反復的實驗。
9.在誘導的不同時間（如1、2、4和6 h）取1 ml樣品放于微量離心管中，測定A₅₅₀，室溫高速離心1 min。
10.沉淀懸于100μl 1×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃加熱3 min，室溫高速離心1 min，冰上放置，待全部樣品處理完后上樣。
11.樣品加熱至室溫，取40μg或相當于0.15 OD₅₅₀培養物的懸液上于10% SDS聚丙烯酰胺凝膠。
12.8～15 V/cm點泳，至溴酚蘭遷移到分離膠底部。
13.考馬斯亮藍染色或銀染，或免疫印跡，觀察表達產物條帶。
   37℃誘導30 min的陽性對照，有一條分子質量為26 kDa的谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）帶，GST的量在誘導過程中持續升高。誘導一定時間的重組菌應有一條與預計大小一致的帶，誘導動力學和蛋白穩定性可能不同于GST對照。
 大量表達靶蛋白
14.挑取一個重組大腸桿菌菌落接入50 ml含氨芐（50μg/ml）的LB培養液，在250 ml搖瓶中于20～37℃過夜培養。
15.取5～50 ml過夜培養物接入450～500 ml含氨芐（50μg/ml）的LB培養液，在2L搖瓶中于20～37℃振蕩培養過夜，至對數中期（A₅₅₀=0.5～1.0）。
16.以預試驗確定的最佳IPTG濃度、最佳時間和最佳溫度誘導表達靶蛋白。
17.誘導適當時間后，于4℃以5000g（5500 r/min Sorvall GSA轉頭）離心15 min收集細胞，繼續后面的純化方案。
*用T7噬菌體啟動子在大腸桿菌中表達克隆基因
含重組表達載體的大腸桿菌菌株的構建
1. PCR修飾或限制性內切酶消化分離DNA片段，片段5’端和3’端帶有與T7噬菌體啟動子表達質粒（如pET載體；Studier et al. 1990）對應的限制酶位點。
2.含靶cDNA/基因的DNA片段與表達載體連接。
3.連接產物轉化大腸桿菌菌株HMS174（DE3）或BL21（DE3）。將轉化體鋪于含氨芐（50μg/ml）的NZCYM平板，于37℃過夜培養。
4.通過菌落雜交和/或小量制備質粒的限制酶切分析、寡核苷酸雜交或序列分析篩選帶有插入片段的轉化體。
 誘導靶蛋白表達的優化
許多研究表明細胞生長速率嚴重影響外源蛋白的表達，因此必須對接種細菌量、誘導前細胞生長時間和誘導后細胞密度進行控制。生長過度或過速都會加重細菌合成系統的負擔，導致形成包涵體。
5.對照菌和重組菌分別挑取1～２個菌落，接入1 ml含氨芐青霉素（50μg/ml）的NZCYM培養液，37℃培養過夜至飽和。
6.取50μl接入5 ml含氨芐青霉素（50μg/ml）NZCYM培養液，在50 ml搖瓶中于37℃培養2 h。
7.吸出1ml未經誘導的培養物放在一個微量離心管中，按下面步驟9和10所述進行處理。
8.在剩余培養物中加入IPTG至終濃度1 mmol/L，20～37℃繼續通氣培養。
9.在誘導的不同時間（0.5、1、2和3 h）取1 ml樣品放于微量離心管中，測定A₅₅₀，室溫高速離心1 min。
10.沉淀懸于100μl 1×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃加熱3 min，室溫高速離心1 min，冰上放置，待全部樣品處理完后上樣。
11.樣品加熱至室溫，取40μg或相當于0.15 OD₅₅₀培養物的懸液上樣于10% SDS聚丙烯酰胺凝膠。
12. 8～15 V/cm電泳，至溴酚蘭遷移到分離膠底部。
13.考馬斯亮藍染色或銀染，或免疫印跡，觀察表達產物條帶。
 大量表達靶蛋白
14.挑取重組和對照大腸桿菌菌落分別接入50 ml含氨芐（50μg/ml）的NZCYM培養液，在250 ml搖瓶中于37℃過夜培養。
15.取5～50 ml過夜培養物接入450～500 ml含氨芐（50μg/ml）的NZCYM培養液，在2 L搖瓶中于37℃振蕩培養至對數中期（A₅₅₀=0.5～1.0）。
16.以預試驗確定的最佳IPTG濃度、最佳時間和最佳溫度誘導表達靶蛋白。
17.誘導適當時間后，于4℃以5000g（5500 r/min Sorvall GSA轉頭）離心15 min收集細胞，繼續后面的純化方案。