實驗概要
先前的研究表明，DC衍生的外質體與Tag共孵育后可在同源和異源小鼠上誘導抗鼠弓形蟲保護性免疫應答。免疫保護與誘導了體液和細胞特異性TAg反應有關。
本研究中，我們評估了在懷孕的小鼠上DC衍生的外質體是否能誘導保護性免疫應答，并在實驗模型中是否能預防小鼠先天性弓形體病。
實驗材料
1. 動物
6-10周的CBA/J小鼠
2. 寄生蟲
鼠弓形蟲 RH株速殖子 76K株囊腫
實驗步驟
1. 弓形蟲屬超聲處理的準備
清洗速殖子，超聲處理，離心。最后一次離心的上清液作為抗原的來源。蛋白濃度用蛋白試劑盒檢測，以牛血清蛋白(BSA)作為標準。等分裝好存于-80度備用。
2. DC細胞系和外質體分離
SRDC DC系
SRDC是脾細胞DC系，形態、表型和活性與那些從活體純化來的CD8a CD205 CD11b- DCs相似。SRDCs培養與完全培養基。SRDC衍生的外質體的制備通過對SRDC上清液的各種不同的離心法。外質體的蛋白濃度用試劑盒檢測。
3. 抗原與DCs共培養
SRDCs在含有TAg的完全培養基中孵育12h。然后徹底清洗，計數，用與免疫。
4. 小鼠接種疫苗
雌性小鼠脾下注射100萬TAg共孵育的SRDCs或100萬SRDCs，或10ug TAg共孵育的外質體或未孵育的外質體，對照組有：未免疫未感染、未免疫感染，注射10ug TAg.
5. 評估抗先天性弓形蟲病的保護性
二次免疫后2星期，每組被分為兩個亞組，第一組用于評估對先天性弓形體病的保護效應，第二組用于評估慢性弓形體病的保護效應。第一組未交配過的雌性老鼠注射疫苗，并與雄性老鼠交配，在懷孕期第13天接種25個囊腫。分析胎兒的存活率和檢測體重。42天后眼球采血，血樣存于-20度，用于檢測體液反應。殺死小鼠，分析細胞反應，分析脾細胞和腸系膜淋巴結T細胞的增殖，細胞因子產量，腦組織囊腫數。
6. 體液反應
用ELISA滴定血樣中特異性抗原IgG、IgG-1、IgG-2a、IgG-2b和抗體IgG-3。抗原特異性抗體滴度檢測，最高稀釋度的倒數，在同樣稀釋度下比對照組高2倍的吸光度。結果用對數表達。腸分泌物中分泌型IgA(IgAs)用免疫印跡法檢測，感染小鼠的血清和腸分泌物和1E5 mAb 作為陽性對照。
7. 抗原刺激細胞增殖反應
出生后6周，在無菌條件下，采集脾和腸系膜淋巴結。脾和淋巴結通過血液尼龍過濾網擠壓除去組織碎片并產生單個細胞懸浮。低滲休克法除去脾紅細胞。細胞懸浮于RPMI-1640(加了FCS、HEPES、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉……)。細胞接在96孔的平板中，每孔50萬細胞和200uL培養基，或加5ug TAg 或加10ug的伴刀豆素蛋白A作為增殖的陽性對照。37度，5%CO2孵育3天，最后18h時加入1uCi [3H] thymidine。玻璃纖維過濾器收獲細胞，合并入增殖細胞DNA的[3H] thymidine用LSC檢測。增殖指數用刺激指數表達。
8. 細胞因子含量測定
用TAg刺激過的脾臟和腸淋巴結釋放的細胞因子的檢測，在培養基的上清液收集IL-5和IL-4(24h)，IL-2(48h)，IFN-γ(96h)。用ELISA試劑盒檢測。
9. 腦中的囊腫
6周后殺鼠，懷孕的和雌性的小鼠在攻蟲2個月后殺死，取腦。每個腦加5 ml RPMI后研碎，在顯微鏡下計數囊腫。