突變檢測
高分辨熔解曲線分析已用于DNA序列突變的檢測，是第一個用于基因分型中的技術[Wittwer等,2003]。簡便、廉價、容易使用、高靈敏性和高特異性是它的突出特點，使它成為一種用于基因分型和診斷應用實驗室中有吸引力的新工具。在薩普，表S1給出了我們所能找到的基于人類基因的實驗。高分辨熔解曲線分析系統結合功能強大的軟件工具可以便利地自動分析，然而人工檢測依然可用。目前，使用高分辨熔解曲線分析檢測突變已經通過審查[Erali
et al.,
2008];因此，我們僅用于一般解釋。此外，高分辨熔解曲線分析用于人類突變的檢測已經有多篇文章發表。充分說明了其目前的發展水平(see also
Supp. Table S1)。
Tindall等[2009]對比了兩種設備和熒光染料，特別是高GC含量片段DNA突變的檢測。
他們說明了高分辨熔解曲線分析的限制，謹慎使用它作為臨床診斷的唯一方法。Nguyen-Dumon等[2009]表明包含使用已知SNP結合稀有突變熔解探針顯著減少測序的能力。Van
Der
Stoep等[2009]類似的方法設計了覆蓋BRCA1基因的序列突變掃描，包括已知頻率SNP的熔解探針。EuroGenTest通過多個實驗室進行評估和驗證HRMA作為新基因篩查的準則。在對28個失明患者的研究結果為100%的靈敏度、98%的特異性，假陽性率低。Rouleau等[2009]在同一個實驗中使用一些設備完成定量PCR和HRMA去篩查核苷酸數量（缺失/重復）和質量的改變。最后，Dobrowolski
等[2009]描述了在兩小時之內使用HRMA掃描16.6kb人類線粒體基因組（mtDNA）序列突變。線粒體DNA突變的識別比較復雜，因為許多是異質的，同時突變等位基因以高變化率存在。事實上，作者成功地確認在1-100%的突變存在，很好地顯示了HRMA檢測定量變化的靈敏度（見量化）
盡管已有報道HRMA片段達600bp或更高，但我們的實驗顯示該技術對小片段更靈敏。對于片段篩查，使用150-250bp片段，通常每個外顯子一個片段。當實驗進行的是特異突變，我們的目標片段大小是80-100bp。我們發現高靈敏度的關鍵是熔解圖不會超過一到兩個熔解區域。當片段包含了多個熔解區域，并不是所有的突變能檢測出來。目前新的實驗設計簡化了強大的可用性設計項目，大多數情況下是和儀器一起交付。
在早期HRMA實驗中可以看到兩個有時甚至三個PCR產物熔解，可以提高結果。同樣，特別是當DNA片段分濃度差異較大時，添加1
μL高鹽緩沖液（1.0M KCL,0.5M Tris-HCL [PH=8.0]）可以改善實驗結果（圖
2）。添加鹽可以提高分辨率同時促進集群，但這種方法的成功率是不可預測的，它取決于樣品、片段和突變分析。
圖2.高鹽的影響.A:HRMA一系列樣品的分析。B：同樣的樣品在A分析后添加1 μL 1.0M kcl/0.5M Tris-HCl(PH=8.0)再熔解。留意分離的改善和三組圖像變尖。
當一些簡單的原則都考慮到時（比如，避免長片段和多重熔解域），設計一個基因的HRMA篩查非常簡單。我們曾成功地設計實驗篩查MDM基因第79個外顯子90個片段(Al-Momani
et al)。Nguyen-Dumont 等 [2009] 和Van Der Stoep
等[2009]表明，非標記探針識別已知非致病突變時，不僅省時而且能夠節約成本。防止這些片段不必要的測序，同一個片段避免忽略其它突變。
應該指出HRMA曲線的形狀通常不足以區分一個特異突變[Tindall 等,
2009];完成這個實驗必須添加探針或片段測序。非標記探針區分特異探針或復等位基因的能力式驚人的。圖1B-D為例子(Roos
等，準備)。使用包含野生型序列的熔解探針可以區分MBL2基因中三種相近空間突變的10種可能等位基因。
最便宜的熔解探針3ˊ磷酸鹽封閉可以防止PCR過程中的延伸。遺憾的是，這種探針不穩定，同時會出現不理想的額外熔解峰。其它探針較穩定但價格昂貴。Zhou等[2008]
使用snapback 引物完美的解決了這個問題，它是5ˊ端引物包含了循環區域和序列互補其延伸產物，覆蓋突變篩查。
HRMA的一個缺點是對純合子突變的檢測。盡管隨著目前的發展分辨率已得到很大提高 [Gundry 等.,2008],
對一些突變的差異（如A-T到T-A改變）由于變化非常小所以很容易錯過。尤其是分析不同來源的樣品，樣品到樣品的變化、實驗噪音增加和微小的變化可能不能被檢測到。因此，序列突變篩查應用時（臨床診斷），我們堅持使用樣品混合產生異源雙鏈。首先，樣品熔解得到一個標準的熔解曲線。下一步，使用圖表顯示（圖3為DMD設計，X軸與疾病相關），混合樣品同時產生第二個熔解曲線。樣品混合圖每個樣品產生了兩個雜交雙鏈（樣品很容易地自動混合）。純合子將產生兩個雜交雙鏈，極大地提高了純合子的檢測。雜交雙鏈將通過預混的熔解曲線檢測到，盡管它們通常通過混合樣品顯而易見。（混合比例為1︰3）。當混合相同突變樣品時，僅顯示失敗的樣品，可以通過增加更多的控制或僅混合不相關的樣品可以簡單地預防
。必須指出 體系的存在可以從真正的純合子等位基因區分半合子。
圖3.生成異源雙鏈。為了確保純合子突變的檢測，可以使用顯示的方案。板孔1-12包含每個樣品（患者A-F和wt=wild-type控制）不同片段（外顯子）的PCR產物。第八排為空。從第一個從第七排（wt，5-10
μL
PCR產物）樣品的一半HRMA混合開始，然后轉向第八排。隨后，第六排一半量轉向第七排，第五排一半轉向第六排等等等。最后，第八排轉向第一排，然后片段再次熔解。
應當指出，HRMA檢測雜合子的靈敏度高于DNA測序。因此，當HRMA顯示突變存在，而測序不能確認時。可能是這個突變存在也樣品相對小的片段（體細胞嵌合體）。其它技術：如，克隆+測序或單分子稀釋+PCR和HRMA，可以確認這些突變。