| 實驗步驟 |
一、用CLUSTALX軟件對已知DNA序列做多序列比對。
操作步驟：
1. 以FASTA格式準備8個DNA序列test.seq（或txt）文件。
2. 雙擊進入CLUSTALX程序，點FILE進入LOAD SEQUENCE，打開test.seq（或txt）文件。
3.
點ALIGNMENT，在默認alignment parameters下，點擊Do complete Alignment
。在新出現的窗口中點擊ALIGN進行比對，這時輸出兩個文件（默認輸出文件格式為Clustal格式）：比對文件test.aln和向導樹文件test.dnd。
4. 點FILE進入Save sequence as,在format 框中選PHYLIP，文件在PHYLIP軟件目錄下以test.phy存在，點擊OK。
5. 將PHYLIP軟件目錄下的test.phy文件拷貝到EXE文件夾中。用計事本方式打開的test.phy文件的部分序列如下：
圖中的8和50分別表示8個序列和每個序列有50個堿基。
二、用PHYLIP軟件推導進化樹。
1. 進入EXE文件夾，點擊SEQBOOT程序輸入test.phy文件名，回車。
圖中的D、J、R、I、O、1、2代表可選擇的選項，鍵入這些字母，程序的條件就會發生改變。D選項無須改變。J選項有三種條件可以選擇，分別是Bootstrap、Jackknife和Permute。文章上面提到用Bootstraping法對進化樹進行評估，所謂Bootstraping法就是從整個序列的堿基（氨基酸）中任意選取一半，剩下的一半序列隨機補齊組成一個新的序列。這樣，一個序列就可以變成了許多序列。一個多序列組也就可以變成許多個多序列組。根據某種算法（最大簡約性法、最大可能性法、除權配對法或鄰位相連法）每個多序列組都可以生成一個進化樹。將生成的許多進化樹進行比較，按照多數規則（majority-rule）我們就會得到一個最“逼真”的進化樹。Jackknife則是另外一種隨機選取序列的方法。它與Bootstrap法的區別是不將剩下的一半序列補齊，只生成一個縮短了一半的新序列。Permute是另外一種取樣方法，其目的與Bootstrap和Jackknife法不同，這里不再介紹。R選項讓使用者輸入republicate的數目。所謂republicate就是用Bootstrap法生成的一個多序列組。根據多序列中所含的序列的數目的不同可以選取不同的republicate，此處選200，輸入Y確認參數并在Random
number seed (must be odd)
的下面輸入一個奇數（比如3）。當我們設置好條件后按回車，程序開始運行，并在EXE文件夾中產生一個文件outfile，Outfile用記事本打開如下：
這個文件包括了200個republicate。
2. 文件outfile改為infile。點擊DNADIST程序。選項M是輸入剛才設置的republicate的數目，輸入D選擇data sets，輸入200。
設置好條件后，輸入Y確認參數。程序開始運行，并在EXE文件夾中產生outfile，部分內容如下：
將outfile文件名改為infile，為避免與原先infile文件重復，將原先文件名改為infile1。
3. EXE文件夾中選擇通過距離矩陣推測進化樹的算法，點擊NEIGHBOR程序。輸入M更改參數，輸入D選擇data sets。輸入200。輸入奇數種子3。
輸Y確認參數。程序開始運行，并在EXE文件夾中產生outfile和outtree兩個結果輸出。outtree文件是一個樹文件，可以用treeview等軟件打開。outfile是一個分析結果的輸出報告，包括了樹和其他一些分析報告，可以用記事本直接打開。部分內容如下：
4. 將EXE文件夾中的outfile文件名改為outfile1，以避免被新生成的outfile 文件覆蓋。點擊CONSENSE程序。輸入Y確認設置。EXE文件夾中新生成outfile和outtree。Outfile文件用記事本打開，內容如下：
5. 將EXE文件夾中的intree文件名改為intree1，將outtree改intree。點擊DRAWTREE程序，輸入font1文件名，作為參數。輸Y確認參數。程序開始運行，并出現Tree Preview圖。
6. 點擊DRAWGRAM程序，輸入font1文件名，作為參數。輸Y確認參數。程序開始運行，并出現Tree Preview圖。
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