三、端粒克隆DNA的抽提
1.準備含特定抗生素50μg/mL氨芐青霉素、35μg/mL卡那霉素或12.5μg/mL氯霉素）的LB平板。
2.從-70℃取出甘油保存管，放在干冰上。
3.取甘油保存的菌種在LB平板劃線后，37℃細菌培養箱培養過夜。
4.加100mL 2×YT培養基到500mL離心管中，按步驟1所示濃度加抗生素。
5.從平板上挑選單克隆接種到2×YT培養基，37℃搖床中培養過夜。
6.取700μL細菌培養物加300μL100%甘油混合均勻，分裝在兩個Eppendorf管中，標記好，-70℃條件下保存。
7.剩余的細菌培養物350g離心15min。
8.棄上清，將離心管倒扣在紙上瀝干。
9.用30mL冷的細胞重懸液懸起沉淀，劇烈混勻和抽吸幾次，使得小細胞團塊徹底懸起10.加30mL細胞裂解液，上下輕輕顛倒一次。
11.室溫放置5min(不要延長時間）。
12.立即加30mL冷的中和液，上下輕輕顛倒混勻。
13.冰上放置15min，每5min上下顛倒幾次。
14.4℃下4000g?離心40min。
15.標記好一個新的250mL離心管，上面放一個塑料漏斗。
16.剪一個圓形的雜交網篩，中間剪開一個裂縫，裝到漏斗上。
17.小心將離心的上清倒在網篩上，液體經過網篩和漏斗收集到250mL離心管里，注意不要有絮狀物穿過網篩。
18.移去漏斗、網篩，用水、乙醇清洗以備下次使用。
19.加0.7倍體積的無水異丙醇沉淀DNA。
20.混合均勻，4000g離心10min。
21.棄上清，加入25mL70%乙醇。
22.振蕩混勻，4000g離心10min。
23.棄上清，將離心管倒扣在紙上以去掉多余液體。
24.用1mL TE(pH8.0)重懸DNA沉淀。
25．取5μL抽提的DNA在0.9%的凝膠上電泳檢測，用Xmnd III DNA作
為參考標準，完整的黏粒大小應該在大分子質量的位置。
26.測量抽提的DNA濃度（如使用熒光光度計)。
27.在-20℃儲存抽提的DNA。
四、用缺口平移法間接標記端粒克隆DNA
1.將Eppendorf管放在冰上，然后加入1.0μg待標記DNA、1.2μL生物素-16-dUTP(如果標記短臂探針）或地高辛-11-dUTP(如標記長臂探針）等，加蒸餾水至總體積50μL。
2.輕輕振蕩，稍離心以去氣泡。
3.在15℃水浴中反應90min。
4.將反應體系放在冰上暫停反應。
5.取5μL在2%的瓊脂糖凝膠上檢測片段大小，用Phi×174作為DNA大小的參考標準。
6.最適于雜交的片段大小為50?500bp條帶。如果片段大于500bp，則補加1.0μL DNase I，15℃孵育30min
7.當探針大小合適時，用裝有交聯葡聚糖G50的SELECT-B離心柱過柱去掉未結合的核苷酸。
8.加25μL鮭魚精DNA(若標記的探針超過1嘩，則按比例增加鮭魚精DNA。
9.加蒸餾水調整探針濃度為10ng/μL(應扣除已用于檢測的探針量）。
10.記錄10ng/μL探針混合物的體積。
11.每微升探針混合物加入適量的人Cot-1DNA[加入量依據探針和原始插入的片段大小而定。
12.計算好含120ng探針的人Cot-1DNA/探針混合物的體積，按體積取出移到新的Eppendorf管中。
13.在真空離心機中離心干燥Cot-1DNA/探針混合物（注意不要過于干燥)。
14.為了獲得某染色體長短臂端粒特異性探針雜交液混合物，將Cot-1DNA/長臂或短臂探針混合物分別重懸在38μL雜交液中，兩者合并成76μL雜交液。
15.若制備單獨檢測長臂或短臂端粒的探針，則將Cot-1DNA/探針混合物直接重懸在76uL雜交液中。
16．混勻后在-20℃條件下儲存。
五、間接標記探針的雜交和雜交后處理
（1）雜交
1.打開加熱板，調整溫度到75℃并預熱。
2.取18斗探針雜交液到Eppendorf管，并預熱到37℃(水浴鍋或加熱
板)。
3.按照3.2.1中所示方法調整細胞懸液至最佳濃度。
4.將高質量顯微載玻片浸泡在無水甲醇中2min。
5.用干凈的軟紙擦干片子。
6.將10?20；×L調整好濃度的細胞懸液滴加到載玻片的中央。
7.將標本放置干燥，用相差顯微鏡的1〇倍物鏡檢查標本的質量。
8.在磨砂處標記實驗內容，用鉆石筆在載玻片背面劃定樣品區域。
9.準備一個染色缸裝2×SSC，三個染色缸依次裝70%、85%和100%的乙醇。
10.將制備好的片子（用固定的細胞懸液點樣）用2×SSC洗2min，然后依次在70%、85%和100%的乙醇中各脫水2min。
11.片子空氣干燥后，有樣品一面朝上放在37℃加熱板上12.輕輕上下抽吸混勻預熱的雜交液，小心不要產生氣泡。
13.吸取雜交液加到鉆石筆劃定區域的中央。
14.小心地將一個22mm×22mm蓋玻片蓋到雜交液，用鈍頭鑷子輕輕按壓排掉氣泡。
15.小心地將片子（蓋玻片一面朝上）放在75℃加熱板上。
16.變性、1?3min，變性時間取決于細胞懸液的老化程度
17.變性后立即轉移到預熱的避光塑料玻片盒中，37℃水浴中雜交過夜（水浴鍋不蓋蓋子）。