多重 PCR反應的基本原理
DNA 引物（步驟 1 和 2 ） . 引物的選擇遵從簡單的規則：引物長度為 18-24bp 或更長， GC 含量為 35%-60% ，退火溫度 55 ℃ -58 ℃或更高。長些的引物（如 DMD 基因的引物， 28-30bp ）使反應在更高的退火溫度下進行并產生較少的非特 異性產物。使用軟件 Primers 1.29( 從 ftp.bio.indiana.edu 下載的免費軟件 ) 來計算熔點并檢測可能的引物間的相互作用。使 用 BLAST 工具在 NCBI 序列數據庫中對多對引物進行比對，以檢測可能的重復序列。
單基因的 PCR( 步驟 3). 首先設計了一個分別單獨擴增所有基因的 PCR 程序。反應混合物包括： 1xPCR 緩沖液， 0.4 μ M 引物， 5% DMSO 和 1U Taq DNA 聚合酶，共 25 μ L 反應體積。將在同一臺 PCR 儀，在同型號的不同 PCR 儀上，在不同型號 PCR 儀上及在不同制造商的 PCR 儀上進行的擴增反應結果進行比較。在同一臺 PCR 儀上或在同型號的不同 PCR 儀上擴增，實驗的重復性很好，但在不同制造商的 PCR 儀上進行的擴增反應結果有明顯差異，但是通過對循環條件的調節可以得到好的重復性。實驗表明對于 100-300bp 的基因擴增產物，通過降低延伸溫度可以增加某些產物的產量。對于單一 PCR 反應，退火時間與延伸時間并不明顯影響結果，但改變退火溫度可以改變 PCR 產物的特異性和產量。對于擴增 22Y 特異基因 (Figure 2a) ， PCR 程序 A 得到最佳結果 (Table 2) 。
多重 PCR ：等物質量的引物混合物（步驟 4 ） . 將引物以各種方式混合在同一反應中同時擴增多個基因要求對某些反應參數進行改變或優化 (Table 1 和 Figure 2b) 。初次進行多重反應時，各種引物按相等的摩爾數添加是很有必要的。結果將會揭示哪些引物的濃度或是哪些參數需要改變。下面將解釋并討論一些優化的例子，由于許多參數被提及不止一次，因此這些例子并未嚴格遵照 Figure 1 中所列的步驟。
多重 PCR反應循環條件的優化
延伸溫度（步驟 5 ， A-C ） . Figure 2c 展示了當加入相等量 (0.4 μM each) 的四種用于擴增 Y 染色體上不同基因的引物進行多重 PCR 時，用程序 A 和程序 B 擴增得到的結果 (Table 2) ，程序 B 有更高的延伸溫度 (72 ℃ ) 和更長的退火和延伸時間。總的來說，用程序 A 對 Y-1, Y-3* 和 Y-4 的擴增得到了更高產量的 PCR 產物。此外，用程序 B 擴增時某些產物消失 (Y-1 、 Y-2) ，同時出現了某些非特異性的擴增產物 (Y-1 、 Y-3*) 。程序 B 得到的結果更差一些，表明高的延伸溫度減少了某些基因的擴增，盡管我們試圖用長的退火時間和延伸時間來消除這種影響。
延伸時間（步驟 5 ， A, B 和 D ） . 在多重 PCR 中，由于同時擴增多個基因，酶和 dNTP 的缺乏就成為限制因素，就需要更多的時間來完成所有產物的合成。兩個實驗表明了延伸時間的影響。在一個實驗中，一對 Y 染色體引物 (Y6BaH34pr, 910bp) 被加入 X 染色體引物混合物 (X-3) 中。結果表明 (Figure 3b) ，多重 PCR 中增加延伸時間 ( 程序 A 與程序 D) 可以增加較長的 PCR 產物的產量。在另一個實驗中，用程序 C 和 A （ Figure 3a 和 Table 2 ）擴增四個 Y 染色體上的基因。當延長延伸時間時，所有基因的 PCR 產物量都增加了。
退火時間和退火溫度 （步驟 5 ， A-D; Figure 1 ） . 將退火時間從 20 秒改為兩分鐘并未改變擴增效率，但退火溫度卻是最重要的參數之一。盡管許多基因能在退火溫度為 56 ℃ –60 ℃被特異的擴增，我們的經驗表明 將退火溫度降低 4 ℃ –6 ℃對于在多重 PCR 中擴增出同樣的基因是必需的。 Figure 3, d–f 展示了這種情況，單獨擴增時退火溫度為 60 ℃的基因在多重 PCR 中退火溫度為 54 ℃時最優。盡管在 54 ℃時可能出現非特異性擴增（如 Figure 3c ），但多重反應中并發的其他基因的特異擴增會消除非特異性擴增的影響。相似的，當同時擴增許多特異的基因時，擴增效率高的基因會使擴增效率低的基因的擴增產量降低。這是由于在 PCR 反應中酶和 d NTP 的供應是有限的，所有的產物都是由同樣的一組原料生成。
PCR 循環數 . 引物混合物 Y-3* 被用于擴增兩個不同的基因組 DNA 樣品，以不同的循環次數做多次實驗 (Figure 4a) 。其中的一個基因組模板質量更高或 DNA 含量更高。可以看出，當循環數增加時，兩組樣品的各擴增帶的產量都逐漸增加。 PCR 產物量增加最明顯是在 25 個循環附近。通常對于一個反應， 28 至 30 個循環足矣，增加至 60 個循環對產物量無明顯影響。
多重反應中試劑組分的優化
當使用同樣的擴增程序時，不同的實驗間存在差異 (Figures 2c 和 3a) 。解決重復性問題要求調節 PCR 反應組分。
引物的量 ( 步驟 5, B 和 C). 最初，在多重 PCR 反應中使用了相等物質量的引物（每種引物為 0.2–0.4 μ M ） (Figure 3c) 。但是擴增并非均一的，即使在優化了循環條件后，某些基因的擴增產物仍不明顯。解決這一問題，要求改變反應中各種引物的比例，要增加"弱"基因的引物量，而要減少"強"基因的引物量。不同基因相對的引物終濃度有明顯的差異 (0.04–0.6 μ M) ，這完全取決于經驗。