大化所發展時空超分辨四維熒光成像解析全細胞溶酶體

近日，我所分子探針與熒光成像研究組（1818組）徐兆超研究員團隊發展了在酸性條件下，可自閃爍的單分子定位超分辨成像熒光探針LysoSR-549，實現了在12nm/20ms時空分辨率下，長達40分鐘的全細胞溶酶體解析。

　　長時間超分辨熒光成像對于揭示納米尺度的細胞器動力學和功能越來越重要，但由于缺乏高度光穩定和環境敏感的熒光探針為研究工具，一直以來，科研人員對細胞器互作網絡的功能和調節機制，尤其是細胞器納米級全景分布和時空過程所知尚少。

　　溶酶體是多功能細胞器，在降解生物分子、介導細胞代謝和細胞信號傳導中發揮作用。溶酶體功能障礙在溶酶體貯積癥、神經退行性疾病和癌癥中的作用也已得到證實，使得溶酶體成為疾病治療靶點之一。溶酶體多重功能是通過溶酶體與其他細胞器的融合或接觸來實現，并由溶酶體動力學介導，包括溶酶體的運動、溶酶體數量、大小、形態和腔內酸性變化等。越來越多的證據表明，每個具有不同位置、運動軌跡和化學成分的溶酶體都具有特定的功能；但溶酶體又同時受到系統水平上的調節，以溶酶體簇等集體行為在整個細胞內發揮功能。破譯全細胞溶酶體的空間分布、化學成分和動力學可以了解和發現溶酶體的多功能和作用網絡，解析溶酶體個體功能與系統調控之間的關系。但溶酶體腔內是pH為4.5至5的酸性環境，使得熒光探針無法在此條件下實現長時間的時空超分辨和對溶酶體酸性的動態識別。

　　本工作中，該團隊將鄰甲基吡啶引入到羅丹明螺酰胺中，開發了自閃爍探針LysoSR-549。研究發現，吡啶與異吲哚啉酮處于平面結構，并且吡啶N與羰基處于反式構型。由于吡啶的堿性大于羰基，因此在弱酸性下，質子優先與吡啶N結合而遠離羰基；隨著酸度的增加，吡啶環旋轉，質子同時與羰基結合，使pH在4.5至5范圍內的少量染料發生開環反應，形成熒光兩性離子；隨后又與呫噸環10號位-C發生親核加成反應，迅速恢復為不發熒光的螺內酰胺，從而完成一次閃爍過程。

　　基于上述反應機理，LysoSR-549自閃爍參數pKcycl被降低到3.2，使其能夠在溶酶體pH下進行單分子定位超分辨成像（SMLM），并達到了12nm/20ms時空分辨率，這是目前所報道的溶酶體超分辨成像中最高的定位精度。同時，溶酶體內負載了大量的探針，由于只有少數探針處于閃爍發光狀態，這就賦予了探針緩沖能力來抵抗光漂白，使得LysoSR-549呈現出較好的光穩定性，實現了40分鐘的長時間超分辨率成像，從而在單個溶酶體分辨的水平上解析了全細胞內所有溶酶體的運動軌跡，包括觀察到最長運動距離可達50μm，最快運動速度可達0.31μm/s。該探針的單分子光子數與pH值呈線性關系，從而可以在單分子成像過程中識別每個溶酶體pH值，最終實現了單個溶酶體解析水平上，同時分辨整個細胞中所有溶酶體的動態和腔內pH，并根據溶酶體分布、大小和腔內pH值來分辨出全細胞溶酶體亞群。

　　LysoSR-549所具備的解析全細胞溶酶體的能力，使得立體可視化追蹤和分辨溶酶體成為可能，從而可以發現很多之前未知的溶酶體化學和生物學信息，破解溶酶體的生物化學。團隊實現了對整個細胞的所有溶酶體跨時間尺度追蹤，也可以聚焦在某一局部，或某一個溶酶體來做研究。

　　此外，該團隊還對不同外界刺激下的全細胞溶酶體進行了分析，發現不同條件下溶酶體的大小、數量、分布、動力學和腔內pH值均有顯著差異，這可望對溶酶體相關疾病診斷提供新的方法。

　　相關研究成果以“An Acid-regulated Self-blinking Fluorescent Probe for Resolving Whole-cell Lysosomes with Long-term Nanoscopy”為題，于近日發表在《德國應用化學》（Angew. Chem. Int. Ed.）上。該工作的第一作者是我所1818組喬慶龍副研究員。上述工作得到國家自然科學基金、我所創新基金等項目的資助。（文/圖 喬慶龍）

　　原文鏈接：https://doi.org/10.1002/anie.202202961